Coloração Kinyoun

Cryptosporidium parvum tingido com coloração Kinyoun. Fonte: Punlop Anusonpornperm, Wiikimedia Commons

O que é manchas de Kinyoun?

O Coloração Kinyoun É uma técnica de coloração usada para tingir bactérias e parasitas resistentes a alcool com ácido -alcool. Ele nasceu da modificação da coloração de Ziehl-Neelsen. Ambas as técnicas são interpretadas da mesma maneira, mas diferem em dois elementos: na preparação do reagente principal e no qual a técnica Kinyoun não usa calor.

Por esse motivo, também é conhecido como Ziehl-Neelsen em Cold Modified, ou coloração a frio de Kinyoun. É indicado para a cor de Mycobacterium tuberculosis, Leprae mycobacterium, Micobactérias atípicas, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris e Cyclosporras Cayetanensis.

Vale a pena notar que Nocardias Eles são tingidos fracamente com essa técnica, pois são parcialmente ácidos álcool; portanto, para este gênero, há uma modificação da metodologia.

Por sua vez, a técnica de Kinyoun foi combinada com a técnica tricrômica modificada por Didier para a detecção de coccidios (Cryptosporidium parvum e Isopora Belli) e esporos microsporidários (Enterocytozoon Bieneusi e Enchelitozoon intestinalis).

Base

O principal reagente de manchas é a carbolfucsina ou a fenicada fucsin, que tem a propriedade de se juntar aos ácidos carbólicos existentes dentro da parede celular do cavaleiro, ricos em lipídios (ácidos micólicos) de micobactérias e certos parasitas.

Esta união não é neutralizada pelo descolorante ácido; portanto, os microorganismos são definidos como ácido álcool resistente.

Ao contrário da técnica de Ziehl-Neelsen-que corrige o corante através do calor, na técnica de Kinyoun, essa etapa não é necessária, uma vez que a solução de fenicada fucsin que é preparada contém uma alta concentração de fenol.

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O fenol dissolve o material lipídico da parede celular, que permite a entrada do corante da carbolfucsina. Após o corante penetrar, é fixo, apesar da lavagem com ácido álcool.

Dessa maneira, os microrganismos resistentes de ácido álcool tomam a cor vermelha característica, enquanto tudo o que não é ácido álcool é descolorido e tingido azul.

Técnica

Materiais

• Fuchsina fenicada modificada.
• Álco-ácido.
• Azul de metileno.

Preparação de Fuchsina de Kinyoun Phoeniced

• Fuchsina básica: 4 gr.
• Fenol: 8 ml.
• Álcool (95%): 20 ml.
• Água destilada: 100 ml.

A fucsina básica em álcool deve ser dissolvida lentamente, misturando constantemente. Posteriormente, o fenol cristalizado derrete em um banheiro a 56 ° C. Uma vez dissolvido, 8 ml são adicionados à solução de fúcsina anteriormente preparada.

Preparação de ácido álcool

• Ácido clorídrico concentrado: 3 ml.
• Etanol (95%): 97 ml.

Você deve medir, unir e misturar.

Preparação de corante de contraste azul de metileno

• Blue de metileno: 0.3 g.
• Água destilada: 100 ml.

Ele pesa e dissolve.

Técnica de coloração de Kinyoun

• Prepare um mancha diretamente da amostra, que pode ser escarro, líquido pulmonar, sedimento de urina, líquido cefalorraquidiano ou fezes, entre outros, ou de uma suspensão de microorganismos obtidos de colônias puras desenvolvidas em mídia de mídia.
• Fixar a mancha com calor.
• Coloque a mancha na ponte da coloração e cubra com o reagente Fenicada Fuchsin de Kinyoun preparado. Deixe permanecer por 3 ou 5 minutos.
• Lave com água destilada.
• Decore com álcool ácido por 3 minutos e lave novamente com água destilada.
• Decore novamente com álcool ácido por 1 ou 2 minutos até que seja mais colorido.
• Lave com água destilada e deixe drenar, colocando o slide na posição vertical.
• Cubra a preparação com azul de metileno e deixe por 4 minutos.
• Lave com água destilada e deixe secar o ar.
• Examine 40x e depois 100x.

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Se você deseja melhorar e acelerar a coloração de microrganismos resistentes de ácido álcool, é adicionado 1 gota de um agente hidratante (como o sapo nº 7) a 30 ou 40 ml de fenicato fenicate de Kinyoun.

Alguns laboratórios mudam o corante de contraste de metileno azul devido a verde brilhante ou ácido picrico. O primeiro dá uma cor verde ao fundo e o segundo gera uma cor amarela.

Técnica especial de Kinyoun para Nocardias

Para melhorar a coloração de bactérias de gênero Nocardia Uma modificação da coloração de Kinyoun é usada. A técnica é a seguinte:

• Cubra a mancha com Fenicada Fuchsina de Kinyoun por 3 minutos.
• Lave com água destilada.
• Brevemente descolorido com 3% de álcool preparado até que seja mais colorido.
• Lave novamente com água destilada.
• Cubra a preparação com azul de metileno e saia de 30 segundos.
• Lave com água destilada e deixe secar o ar.

Técnica combinada de Fuchsina fenicada e tricrômica modificada por Didier

Esta técnica é recomendada para a análise de amostras de fezes em busca de coccidios e esporos de Microsporidium sp ao mesmo tempo. O procedimento a seguir é o seguinte:

• Cubra a mancha com Fenicada Fuchsina de Kinyoun por 10 minutos.
• Remova o corante e lave com água destilada.
• Decore por 30 segundos com álcool de ácido clorídrico.
• Lave novamente com água destilada.
• Cubra a mancha com solução tricrômica por 30 minutos a 37 ° C.
• Lave com água destilada.
• Decore por 10 segundos com álcool com ácido acético.
• Lave o cheiro por 30 segundos usando 95% de etanol.

Controle de qualidade

Como controle positivo, o smaar é preparado com cepas de Mycobacterium tuberculosis e eles são tingidos com os reagentes preparados para verificar se as bactérias tomam a cor certa (vermelha-fucsia).

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Controles negativos também podem ser usados ​​preparando mancha com qualquer tensão que não seja ácido álcool resistente, verificando assim que toda a amostra pega a cor do contraste.

Técnica Kinyoun em comparação com a técnica Ziehl-Neelsen

A técnica de Kinyoun é mais simples, pois ele elimina a passagem do aquecimento, mas sua principal vantagem é que ela evita a emissão de vapores, altamente tóxicos e causando câncer de longo prazo. Portanto, a mancha de Kinyoun é mais segura para o pessoal encarregado de realizar manchas.

É importante levar em consideração que você deve ter cuidado para que os reagentes não entrem em contato direto com a pele, pois são corrosivos e o descolor é inflamável.

Quanto às desvantagens, um esfregaço negativo não indica necessariamente que o microorganismo não está presente. Além disso, a presença de detritos celulares pode causar falsos positivos, o que gera confusão no diagnóstico.

Referência

1. Química clínica aplicada. Kit BK Kinyoun. Cromakit se recuperou.é.
2. OROZCO-IRO, m. Coloração Kinyoun e dois coccidios no HIV. MD Medical Magazine. 
3. Forbes, b., Sahm, d., Weissfeld, a. Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. Pan -American Editorial S.PARA.