Fundação de teste de oxidase, procedimento e usos

O Teste de oxidase É um método de diagnóstico que mostra a presença do complexo enzimático chamado citocromo oxidase C. Este sistema induz a transformação do citocromo reduzido em oxidado, pois captura oxigênio e isso, por sua vez, atua como o último aceitador de elétrons (H⁺) Na cadeia respiratória.

O termo oxidase é uma maneira sumária de se referir à enzima citocromo oxidase, também conhecida como oxidase indefenol. Nos tempos antigos, acreditava -se que as enzimas citocromo oxidase e independência do indemofenol oxidase eram duas enzimas diferentes, mas hoje se sabe que elas são iguais.

Teste de oxidase positiva e negativa. Fonte: nenhum autor legível por máquina fornecido. Alfa.Prim ~ Commonswiki assumiu (com base em reivindicações de direitos autorais). [Domínio público]

Por sua parte, os citocromos são hemoproteínas que contêm ferro e completam o sistema de citocromo oxidase. Os citocromos podem variar de uma espécie para outra.

Existem diferentes variedades de citocromos (citocromos A1, A2, A3 e 0). Algumas bactérias podem produzir apenas um, mas outros até dois ou três ao mesmo tempo. Nesse sentido, a presença de citocromo A e A3 é conhecida como citocromo - oxidase C. Este é o tipo de citocromo que detecta o teste de oxidase.

Os gêneros Neisseria e Pseudomonas contêm citocroma da oxidase C. Esses gêneros dão o teste positivo da oxidase, ajudando a diferenciá -los dos gêneros Acinetobacter e Stenotrophomonas, respectivamente.

Existem também outros gêneros que são positivos oxidase.

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Base

Características do sistema citocromo oxidase C

O Sistema de Cychocroma C oxidase C atua da seguinte. Este sistema funciona graças ao transporte de elétrons de substâncias doadoras como NADH⁺ Para receber substâncias, neste caso oxigênio.

Isso resulta em energia (ATP) e peróxido de água, dependendo do sistema de citocromo oxidase que possui o microorganismo.

É por isso que as bactérias mais positivas da oxidase também são catalase positiva, uma condição necessária para eliminar o peróxido de hidrogênio produzido, uma vez que essa substância é tóxica para bactérias.

O sistema de citocroma C está presente em algumas bactérias aeróbicas, certos anaeróbicos opcionais, escassos microaerofílicos e sem anaeróbicos rigorosos. Este último é compreensível, já que anaeróbios rigorosos não podem viver na presença de oxigênio; portanto, eles não têm o sistema de citocromo oxidase.

Princípio da prova

Neste teste, use substâncias que atuam como aceitadores artificiais de elétrons, substituindo os nativos dentro da cadeia de transporte de elétrons.

São usados ​​principalmente corantes como parafenylendiamina e indofenol, que atuam como substratos receptores e doadores de elétrons artificiais.

A parafenyndiamina é oxidada pelo sistema citocroma oxidase C. O corante em sua forma reduzido é incolor, mas em sua forma oxidada é colorida.

É assim que a presença do citocromo oxidase C do sistema C; Bem, uma reação positiva gerará uma lavanda ou coloração azul -púrpura, dependendo do reagente usado.

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Por outro lado, se a última substância aceitadora de elétrons na cadeia respiratória for diferente do oxigênio, o teste da oxidase fornecerá negativo (não há produção de cores); Este é o caso de microorganismos anaeróbicos.

Da mesma forma, se o citocromo usado pelo microorganismo for diferente da citocromo oxidase C, também dará o teste negativo.

Procedimento

Para o teste da oxidase, existem vários reagentes e protocolos, todos com o mesmo propósito.

Reagentes

Kovacs Reactive, Gordon e McLeod Reagent, Nadi Reagent, Carpenter Reagent, Suhrland e Morrison, e uso de discos de oxidase.

-Reagente de Kovacs oxidase

Consiste em tetrametil-fenilendiamina dicloridratada a 1%.

O reagente Kovacs é preparado dissolvendo 1 gr da substância mencionada em 50 ml de água destilada. É sutilmente aquecido até sua solução total. Transfira para uma garrafa âmbar de capacidade suficiente e complete o volume a 100 ml com água destilada. Espere pelo menos 15 minutos antes de usar. Salvar na geladeira protegida da luz.

É girado como um reagente de Kovacs oxidase, para diferenciá -lo do reagente Kovacs usado para revelar o teste Indol. Este reagente é o mais sensível, menos tóxico, mas mais caro que o resto dos reagentes.

Uma reação positiva será evidência. Uma reação negativa é evidenciada porque não há mudança de cor na colônia ou é preciso uma leve coloração rosa. O meio também pode escurecer, mas isso não significa reação positiva.

Com este reagente, o tempo de reação é crucial, essa mudança de cor que ocorre entre 5 e 15 segundos é considerada uma reação positiva.

-Reagente de Gordon e McLeod

É composto de dimetil-p-fenilendiamina dicloridratada, também conhecida como n-dimetil-p-fenilendiamina ou p-aminodimetilanilina p-amocoridratada. É preparado conforme descrito para o reagente Kovacs oxidase, substituindo a substância envolvida.

Este reagente é um pouco mais estável do que o reagente Kovacs oxidase, embora todos os reagentes que contenham P-penilendiamina sejam instáveis.

Esta reação está atrasada.

-Reagente Nadi

É composto por 1% de α-naftol em álcool etílico (95% de etanol) e 1% de amina-limanilina. A mistura é preparada em partes iguais e usando álcool etílico absoluto como diliente, até que a quantidade suficiente seja concluída por 100 ml.

-Carpenter reativo, Suhrland e Morrison

É composto por 1% de p-aminodimetilalanina oxalato. Prepare -se da mesma maneira para o descrito para o reagente Kovacs oxidase, mudando para a substância correspondente.

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Com a solução pronta, as tiras reativas são preparadas da seguinte forma: Whatman 6-8 cm número 1.

Eles podem secar sem ter contato com metal, salvar em frascos com o desicto e manter na geladeira. Essas tiras são estáveis ​​por até 6 meses.

É o reagente mais estável de todos mencionados, poder durar em solução até 6 meses. Outro ponto a favor é que o meio não colora a colônia, se for usado direto na placa.

A aparência de uma cor vermelha é interpretada como um teste positivo.

-Discos oxidase

São discos comerciais que são impregnados com reagente para teste de oxidase. Existem várias marcas comerciais no mercado.

Seu uso é bastante prático, pois não devemos preparar reagentes frescos, o que facilita o trabalho. Os resultados obtidos são confiáveis ​​desde que os discos sejam adequadamente preservados.

Protocolos

Método da placa direta, método indireto no papel e uso de discos impregnados com reagentes de oxidase.

-Método da placa direta

2 ou 3 gotas de qualquer um dos reagentes acima mencionados são adicionados para esse fim diretamente na (s) colônia (s) contida em uma placa média de cultura que não contém glicose.

A mudança ou não a cor das colônias é interpretada, não o meio. O tempo de reação válido depende do reagente usado.

-Método indireto no papel

Corte um pedaço de papel de filtro (Whatman n ° 1) para um tamanho de 6 cm² E é colocado dentro de um Petri vazio.

Adicione 2 ou 3 gotas do reagente Kovacs oxidase no papel, participe da colônia que deseja estudar com uma alça de platina ou palito de madeira e estenda -o em uma linha reta no papel de reagente impregnado. Interpretar em um período de 5 a 10 segundos.

Com as tiras preparadas com o carpinteiro, Suhrland e Morrison Reagent, uma colônia se estende na faixa seca. A mesma faixa serve para experimentar várias cepas. Interprete em 10 segundos.

-Discos (mEtodo direto)

Umidade sutilmente umidade discos comerciais com água destilada estéril e supere a colônia para estudar. Recomenda -se usar as placas a 35 ° C, se as placas forem usadas em temperatura ambiente ou placas refrigeradas, a reação é um pouco mais lenta. Interprete a mudança de cor entre 10 e 20 segundos.

Colônias contidas em sangue ou chocolate podem ser usadas.

-Discos (método indireto)

Umedecer o álbum, conforme descrito acima. Coloque -o em um Petri vazio. Tome quantidade suficiente de colônia para estudar com uma alça de platina ou palito de madeira e coloque no disco. Interprete a mudança de cor entre 10 e 20 segundos.

Usar

O gênero Neisseria e Acinetobacter às vezes se assemelham muito a morfologicamente porque, embora o gênero Acinetobacter seja um bacilus gram -negativo, às vezes pode adotar uma forma de cocóide e distribuir em pares, simulando o gênero Neisseria.

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Nesse caso, o teste da oxidase é realmente útil. A neisseria de gênero é positiva e negativa acinetobacter.

No entanto, o gênero Moraxella é muito semelhante ao gênero Neisseria e ambos dão reação positiva; É por isso que sempre temos que realizar testes de fermentação de carboidratos para identificação definitiva.

Por outro lado, o teste da oxidase é útil para diferenciar uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae (toda a oxidase negativa) de outros fermers, como o gênero Pasturel, aeromônios, plesiomonas (oxidase positiva).

O gênero Vibrio e Helicobacter também são oxidase positiva.

Controle de qualidade

Usar cepas conhecidas de Escherichia coli como controle negativo e cepas de Pseudomonas aeruginosa como controle positivo.

Limitações

-Os reagentes devem ser usados ​​recém -preparados, sua vida útil na temperatura ambiente é curta para ser muito instável. Refrigerado pode durar entre 5 dias e 2 semanas.

-Os reagentes são incolores, se mudarem de cor, devem ser descartados. Os discos danificados são evidentes porque ficam escuros com o tempo.

-Uma reação positiva com o reagente da oxidase de Kovacs entre 15 a 60 s é considerado uma reação atrasada e, após 60 segundos, deve ser considerada negativa.

-Ele Haemophylus influenzae Dá uma reação negativa da oxidase, se houver algum reagente com dimetil-p-fenilendiamina, mas positivo se o reagente da oxidase de Kovacs (tetrametil-p-fenilendiamina) for usado).

-Mídia contendo glicose interfere no teste, falsamente negativo.

-As cepas de Bordetella pertussis Eles podem dar uma reação falsamente positiva se vier de placas de ágar de sangue muito concentradas.

-O uso de alças de metal (ferro) dando reação falsamente positiva.

Recomendações

-Porque os reagentes são muito instáveis ​​e tendem a se auto-atualizar.

-Outra maneira de adiar a auto-escala do reagente é adicionar ácido ascórbico a 0,1% no momento da preparação dos reagentes.

-Como os reagentes são instáveis, é recomendável realizar controle semanal de qualidade.

-Os reagentes que não passam no teste de controle de qualidade não devem ser usados.

Referências

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Pan -American Editorial S.PARA. Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Pan -American Editorial S.PARA. Argentina.
3. "Teste de oxidase." Wikipedia, enciclopédia livre. Jan 2018, 10:32 UTC. Abril de 2019, 14:03
4. Organização Mundial de Saúde. Manual de laboratório para a identificação e teste de suscetibilidade a antimicrobianos de patógenos bacterianos de importância para a saúde pública no mundo do desenvolvimento.2004. Disponível em: quem.Int/DrugResistance/InfoSharing
5. Tiras reativas para o diagnóstico de atividade da oxidase em bactérias. Rev. 2000; 52 (2): 150-151.