Fundação de teste de coagulase, procedimento e uso

O Teste de coagulase É uma técnica de laboratório usada para destacar a presença da enzima coagulase. Esta enzima tem a propriedade do plasma coagular. Loeb em 1903 foi o primeiro a descrever esta enzima.

Este teste é realizado para grama de cocos positivos, catalase positiva, permitindo as cepas de Staphylococcus aureus do restante dos estafilococos, já que ele é o único microorganismo de importância clínica que o produz.

Ambas as imagens revelam um teste de coagulase positivo. Fonte: Imagem esquerda: Philippinjl [CC BY-SA 3.0 (http: // criativecommons.Org/licenças/BY-SA/3.0/]]. Imagem à direita: foto tirada pelo autor MSC. Marielsa Gil.

Nesse sentido, os membros da família Staphylococaee que fazem esse teste negativo são frequentemente chamados de Staphylococcus coagulase negativo.

Existem algumas cepas diferentes de S. aureus  que pode produzir coagulase, como Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. Hyicus, s. Intermediário e s. Delphini.

No entanto, os três primeiros são de importância clínica no nível veterinário e raramente podem ser encontrados como um agente causal de infecções humanas, enquanto S. Delphini É encontrado apenas em ambientes marinhos.

Além disso, eles diferem facilmente porque S. Hyicus e S. Intermediário Eles não fermentam o manitol e S. Schleiferi spp coagulans não fermenta a maltose, nem a trehalosa, enquanto S. aureus Sim fermentando esses carboidratos.

A presença da enzima coagulase tem sido associada à virulência de cepas.  No entanto, essa teoria está caindo, tendo em vista o fato de que outras espécies de coagulase negativas virulentas são observadas capazes de produzir infecções importantes.

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Base

Staphylococcus aureus Produz dois tipos de coagulase, um que permanece ligado à parede celular, também chamado de fator de aglutinação ou fator reativo da coagulase (FRC) e um extracelular que é liberado em culturas líquidas. É por isso que eles são chamados de coagulase unida e coagulase livre, respectivamente.

A enzima coagulase deve seu nome à ação que produz. Isso tem a capacidade de transformar o fibrinogênio em fibrina, criando um coágulo evidente quando está no plasma, ou seja, essa enzima simula a atividade da trombina da cachoeira de coagulação.

De fato, uma das teorias mais aceitas é que a coagulase unida reage com a coagulase livre para ativar fatores de coagulação. Essa ativação gera uma substância que age semelhante à protrombina, criando um composto com a função de trombina.

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A diferença com a cachoeira normal de coagulação é que essa reação não precisa da presença de cálcio e não é afetada pela heparina.

Para realizar o teste de coagulase, basta enfrentar uma nova colheita de Staphylococcus com um plasma de coelho de preferência e, assim, observar a formação ou não do coágulo.

Existem técnicas específicas para detectar a coagulase unida e a coagulase unida e gratuita ao mesmo tempo.

Algumas cepas de S. aureus Eles dão um resultado positivo mais rápido que outros. A velocidade da formação de coágulos é diretamente proporcional à atual concentração de coagulase.

A técnica do teste de coagulase no slide detecta as coagulas unidas.

Procedimento

-Teste de coagulase no suporte

Materiais

-Limpe a folha de slides

-Plasma de coelho de preferência, o plasma humano ou de cavalo também pode ser usado. O plasma pode ser adquirido comercialmente liofilizado e reconstituído quando for usado ou pode ser usado fresco (recentemente tirado). Outra alternativa viável é o uso de fibrinogênio.

-Solução salina (0,85%) estéril (SSF).

Obtendo plasma fresco

Extrair sangue venoso humano ou animal. Qualquer um dos seguintes anticoagulantes pode ser usado: EDTA, oxalato de cálcio, heparina ou citrato de sódio. Misture bem e centrífuga. Remova assepticamente o sobrenadante (plasma), sem glóbulos vermelhos e deposite em um tubo estéril.

Separação de plasma. Fonte: Foto tirada pelo autor: MSC. Marielsa Gil.

Plasma liofilizado

Reconstituir conforme especificado pelo Kit Commercial Vial.

Fibrinogênio fresco

De um plasma citrado, misture o plasma com uma solução saturada de cloreto de sódio. Deixar.

Descartar o sobrenadante, reconstituir o precipitar até 5 vezes seu volume com água destilada estéril. Adicione 5 unidades de heparina para cada ml de fibrinogênio. Salvar.

Técnica

Em um slide, uma gota de solução salina e uma gota de plasma é colocada separadamente. Leve com alça de platina 1 ou 2 colônias puras do microorganismo para tentar.

Misture a carga bacteriana na queda do plasma e repita a operação na queda do SSF. Observe os resultados imediatamente. Um resultado positivo será aquele em que a formação de um aglutinado macroscópico (precipitado branco) é observado após um minuto no lado da queda com o plasma.

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A queda do SSF serve como um controle negativo. Se a aglutinação com o SSF for observada, isso significa que o microorganismo é auto-aglutina, sendo capaz de fornecer resultados falsos positivos. Nesse caso, deve ser corroborado com o teste de tubo.

Também é recomendado montar um controle positivo com uma tensão conhecida de S. aureus.   

Interpretação

Aglutinação dentro de 5 a 20 SEG (forte teste positivo).

Aglutinação variável entre 20 segundos e um minuto (teste de atraso positivo).

Um certo grau de aglutinação após um minuto (teste duvidoso). Recomenda -se repetir o teste ou confirmar pelo método do tubo.

Não há aglutinação (teste negativo).

Resultado com SSF. Deve sempre dar negativo, se o resultado do teste for automaticamente.

-Teste de coagulase do tubo

Materiais

-Tubo de teste estéril

-Plasma

-Maria Bath a 37 ° C.

Técnica

Meça com uma pipeta estéril de 0,5 ml de plasma e coloque -a em um tubo de ensaio de 12 x 75. Carregue a alça de platina com 2 a 4 colônias puras para estudar de uma colheita sólida de 18 a 24 horas e datonomá -la no plasma cuidadosamente, misture e incubar a 37 ° C por 4 horas.

Examine o tubo na primeira hora sem agitá -lo, apenas inclinado gentilmente. Se nenhum coágulo ainda for observado, você pode continuar observe a cada 30 minutos até concluir 4 horas. Se após 4 horas ainda for negativo, pode ser deixado até 24 horas, mas à temperatura ambiente. Observe e relate o resultado.

Com base na experiência, alguns microbiologistas recomendam usar 500 µl de uma suspensão bacteriana de uma colheita de 18 horas em um meio líquido para realizar o teste.

Aparentemente, oferece resultados mais rápidos e confiáveis ​​do que quando as colônias de meios sólidos são emulsionados, especialmente se o plasma humano obtido do banco de sangue foi usado.

O uso de cepas de um caldo ajuda a diluir a possível presença de anticorpos anti-estafilocócicos humanos no plasma que podem inibir a ação da coagulase.

Interpretação

Se um coágulo que cobre todo o líquido (coagulação completa) ou coágulo que nada no líquido restante (coagulação parcial) deve ser considerado como um teste positivo.

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Se não for formado, isto é, a suspensão é homogênea, o teste é negativo.

-Teste de coagulase usando fibrinogênio

O fibrinogênio é usado como o plasma e serve tanto para o teste do suporte quanto o teste de tubo. Prossiga conforme descrito para o plasma e interprete da mesma maneira.

Usar

É usado para diferenciar o Staphylococcus aureus de coagulase negativa estafilococos.

Controle de qualidade

Tem culturas frescas de uma tensão de S. aureus Para ser usado como controle positivo. Você também pode ter uma tensão de S. epidermidis como controle negativo.

Limitações

-Um teste positivo não deve ser deixado em incubação por 24 horas, pois o S. aureus produz fibrinolisina que dissolve o coágulo.

-Para teste confiável, deve ser usado plasma fresco ou recém -reconstituído, bem como é importante usar culturas bacterianas frescas (18 a 24 h). Isso evita falsos negativos.

-O teste deve ser realizado em conjunto com um controle negativo e positivo.

-Algum mídia sólida pode interferir no teste de coagulase. Não é recomendado.

-Se o plasma citrado for usado, é recomendável colocar 5 unidades de heparina por ml de plasma para evitar falsos positivos. Isso ocorre porque alguns microorganismos diferentes de S. aureus Eles podem decompor citrato e fazer coágulo de plasma. Nesse caso, é aconselhável fazer grama e um teste de catalase.

-É importante, no teste de tubo, monitorar a reação a cada 30 minutos, pois existem cepas de S. aureus que produzem altas concentrações de fibrinolisina e diluirão o coágulo recém -formado. Evite falsos negativos.

-Ao monitorar o teste, o tubo deve ser evitado abruptamente, isso pode destruir o início da formação do coágulo que não será restaurado, causando falsos negativos.

Referências

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Pan -American Editorial S.PARA. Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Pan -American Editorial S.PARA. Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para a identificação de bactérias de importância clínica. 3ª ed. Editorial pan -americano. bons ares. Argentina.
4. Laboratórios pró-Lab. O plasma coagulado de coelho. Disponível em: Pro-Lab.com
5. "Coagulase." Wikipedia, enciclopédia livre. Fevereiro de 2019, 04:23 UTC. ABR 2019, 15:50 Wikipedia.org.