Características dopi (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol), fundação, uso

Ele DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) É um corante que, por sua propriedade fluorescente, serve como marcador, sendo amplamente utilizado na técnica de microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo, entre outros. A fluorescência que emite é azul brilhante, sua emoção ocorre entre 455-461 nm (luz UV).

O corante dapi pode atravessar a membrana celular de células mortas com grande facilidade. Você também pode tingir núcleos de células vivas, mas neste caso, a concentração disso deve ser maior.

Estrutura química do distrito fluorescente. Fonte: Imagem: Arquivo: DAPI.SVG é uma versão vetorial deste arquivo. Ele deve ser usado no lugar desta imagem raster quando não estiver mais baixo/Richard Wheeler (Zephyris) [CC BY-SA 3.0 (http: // criativecommons.Org/licenças/BY-SA/3.0/)] imagem editada

O corante é capaz de acessar o DNA celular através do qual tem uma afinidade especial, juntando -se com grande avidez às bases de adenina e timina nitrogênio. Por esse motivo, é muito útil em algumas técnicas de biologia molecular.

Este composto pertence ao grupo de corantes indolores e demonstrou ter maior sensibilidade ao DNA do que o brometo de etídio e iodeto de propaganda, especialmente sobre géis de agarose.

O uso desse corante fluorescente é muito amplo, pois é útil: estudar mudanças no DNA nos processos apoptóticos (morte celular) e, portanto, detectar células nesse processo; para foto pegada de DNA (impressão fotográfica do DNA); estudar contaminação bacteriana; o para visualizar a segmentação nuclear.

Também tem sido usado no estudo de bandas cromossômicas, na detecção de DNA de Mycoplasmas sp, Na interação DNA-proteína, na coloração e contagem de células por imunofluorescência e até colorir grãos de pólen maduros.

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Caracteristicas

DAPI é a abreviação de seu nome químico (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Sua fórmula molecular é C₁₆H_quinzeN_5. Tem um peso molecular de 350,3. Perto da faixa de luz UV (345 a 358 nm) a excitação máxima do complexo DAPI-ADN ocorre, enquanto a emissão máxima de fluorescência ocorre entre 455-461 nm.

Este corante é caracterizado por ser uma poeira amarela, mas as estruturas marcadas com este fluoróforo emitem uma luz azul brilhante.

É um composto solúvel em água, no entanto, para acelerar sua dissolução, algum calor pode ser aplicado. Pode ser diluído com PBS, mas não se dissolver diretamente nisso.

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Uma vez preparado o corante, deve ser armazenado na escuridão, isto é, protegido da luz, a uma temperatura de 2 a 8 ° C (geladeira). Sob essas condições, o corante é estável por mais de 3 semanas ou meses.

Se a luz estiver protegida, mas sua estabilidade for deixada à temperatura ambiente para 2 ou 3 semanas, mas exposta à luz direta, a deterioração é muito rápida. Se você deseja economizar por muito mais tempo, pode refrigerar a -20 ° C distribuído em alíquotas.

Base

Essa coloração é baseada na geração de uma contratação nuclear nas principais técnicas de biologia molecular, como: citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e coloração de cromossomos metafásicos ou núcleos de interface, entre outros.

Esta técnica é baseada na grande afinidade que o corante tem para as bases nitrogenadas (adenina e timina) contidas no material genético (DNA) no sulco menor. Enquanto no nível citoplasmático deixa muito pouco fundo.

Quando a união do corante fluorescente para as regiões de adenina e Timina do DNA ocorre, a fluorescência aumenta significativamente (20 vezes mais). A cor emite é azul brilhante. Deve-se notar que não há emissão de fluorescência ao se ligar aos pares de bases GC (guanina-citosina).

É importante destacar que, embora também tenha uma afinidade pelo RNA, isso não causa um problema, porque o maior grau de emissão de energia dessa molécula ocorre em outro comprimento de onda (500 nm), ao contrário do DNA que o faz para 460 nm. Além disso, o aumento da fluorescência uma vez ligado ao RNA é de apenas 20%.

O DAPI é usado mais para tingir células mortas (fixas) que você vive, pois para pintar o último é necessário uma concentração muito maior do corante, isso ocorre porque a membrana celular é muito menos permeável ao DAPI quando está vivo.

O corante DAPI pode ser usado em combinação com fluoróforos vermelho e verde para obter uma experiência multicolorida.

Usar

O DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) é um excelente fluoróforo e, portanto, é amplamente utilizado em várias técnicas e para vários fins. O uso de DAPI é explicado abaixo nas técnicas principais.

Citometria de fluxo

Os pesquisadores Gohde, Schumann e Zante em 1978 foram os primeiros a usar e propor o DAPI como um fluoróforo na técnica de citometria de fluxo, tendo grande sucesso devido à sua alta sensibilidade pelo DNA e sua alta intensidade na emissão de fluorescência.

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O uso de DAPI nesta técnica permite o estudo do ciclo celular, a quantificação das células e a coloração de células vivas e mortas.

Embora existam outros corantes, como brometo de etídio, óxido de Hoechst, laranja acridina e iodeto de propidio, o DAPI é um dos mais utilizados para serem mais fotoestáveis ​​do que os mencionados acima.

Para esta técnica, é necessário. A amostra é centrifugada e o sobrenadante é descartado.

Enquanto o tempo passa pelo corante DAPI com um tampão de coloração (Foxp3 de Biolegend) para um 3 µm.

Centrifugar a amostra, descartar o sobrenadante e depois cobrir com 1 ml de solução DAPI por 15 minutos à temperatura ambiente.

Leve a amostra para o citômetro de fluxo com o laser direito.

Microfluorometria de fluxo

Outra técnica na qual o DAPI é usado está na micro-fluorometria do fluxo junto com outro fluoróforo chamado mitramical. Ambos são úteis para quantificar.

Hibridação No local 

Esta técnica basicamente usa sondas de DNA marcadas com um corante fluorescente que pode ser o DAPI.

A amostra requer ser tratada com calor para desnaturalizar o DNA de duas classes e transformá -lo em duas cadeias monocipenárias. Posteriormente, é hibridizado com uma sonda de DNA de DNAizada marcada com DAPI que tem uma sequência de interesse.

Posteriormente, é lavado para eliminar o que não era hibrid, um contraste é usado para visualizar o DNA. O microscópio de fluorescência permite a observação da sonda hibridizada.

Esta técnica visa detectar sequências específicas no DNA cromossômico, sendo capaz de diagnosticar certas doenças.

Essas técnicas cito-moleculares têm sido úteis para determinar detalhes no estudo dos cariótipos. Por exemplo, evidenciou as regiões ricas em pares de bases de adenosina e timina chamadas regiões heterocromáticas ou bandas dapi.

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Esta técnica é amplamente utilizada para o estudo de cromossomos e cromatina em plantas e animais, bem como no diagnóstico de patologias pré -natais e hematológicas no humano.

Nesta técnica, a concentração de DAPI recomendada é de 150 ng/ml por um tempo de 15 minutos.

As lâminas já montadas devem ser protegidas da luz a 2-8 ° C.

Coloração da imunofluorescência

As células são fixadas com paraformaldeído a 4%. Se outros corantes forem usados, o DAPI será deixado no final como contratação e as células com solução PBS por 15 minutos são cobertas. Enquanto o tempo passa, prepare a solução DAPI diluindo com PBS, para que a concentração final seja de 300 µm.

Em seguida, o excesso de PBS é extraído e coberto com DAPI por 5 minutos. Lave várias vezes. A folha é observada em um microscópio de fluorescência sob o filtro adequado.

Folha de segurança

Este composto deve ser cuidadosamente manipulado, porque é um composto que possui propriedades mutagênicas. O carbono ativado é usado para eliminar este composto de soluções aquosas que serão descartadas.

Luvas, roupão e lentes de segurança devem ser usadas para evitar acidentes com este reagente. Se ocorrer contato ou contato muco, você deve lavar a área com água suficiente.

Você nunca deve se afastar sobre este reagente com a boca, use propipets.

Não contamine o reagente com agentes microbianos, pois isso resultará em resultados errôneos.

Não dilui o corante DAPI mais do que o recomendado, porque a qualidade da mancha diminuirá consideravelmente.

Não exponha o reagente à luz direta ou mantenha o calor porque diminui a fluorescência.

Referências

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