Cromatografia em coluna

O que é cromatografia em coluna?

O Cromatografia em coluna É uma técnica que permite a separação dos componentes de uma mistura de substâncias, a fim de alcançar a purificação de uma substância específica para identificação, caracterização ou uso.

A cromatografia em coluna tem duas fases: uma fase estacionária e uma fase móvel. A fase estacionária pode ser encontrada em uma fase sólida ou líquida e as substâncias a serem separadas interagem com ela, anteriormente ou simultaneamente com a ação da fase móvel.

A degradação das cores indica que as substâncias eluem de maneira diferente por causa de suas variáveis ​​afinidades pela fase estacionária: a substância azulada, para estar mais adiante, é a que sofreu pela retenção mais forte. Fonte: макitivamente м оич, cc por 2.0, via Wikimedia Commons

A fase móvel, por outro lado, se move durante a cromatografia e permite a separação dos componentes da mistura. A fase móvel pode ser encontrada em um estado líquido ou gasoso e interage com substâncias em cromatografia de similaridade em suas polaridades.

A cromatografia em coluna é uma técnica versátil que possui inúmeras aplicações em várias indústrias, bem como na medicina. Portanto, as técnicas cromatográficas evoluíram constantemente: esse é o caso da cromatografia líquida de alta resistência à calçada (HPLC).

O HPLC permite analisar, em um tempo muito curto, inúmeras substâncias, uma vez que todas as etapas do processo são automatizadas. Por exemplo, é muito útil nas sinfinas de análise da qualidade dos medicamentos, onde muitas amostras devem ser analisadas diariamente.

Também temos cromatografia por exclusão de tamanho, o que, como o nome indica, é baseado no tamanho das moléculas e não tanto em suas polaridades. Essa técnica é usada quando é necessária para separar misturas de pigmentos, resinas, asfalto, biomoléculas etc., que não diferem muito em sua natureza química.

Tipos de cromatografia em coluna

Existem vários tipos de cromatografia que são realizados em coluna, estrutura de vidro ou outro material, geralmente na forma de tubos retos. Entre os tipos de cromatografia em coluna estão os seguintes:

• Absorção ou coluna.
• Partição líquido-líquido.
• Troca iônica.
• Exclusão por tamanho.
• Gás.
• Líquido de alta resolução (HPLC).
• Afinidade.

Fundamentos e materiais

Cromatografia em coluna de laboratório

Cromatografia de adsorção ou coluna

Essa cromatografia tem os mesmos princípios que a cromatografia em camada fina, com base no uso de uma fase estacionária sólida da natureza polar (Alumina ou Sylica Gel) e uma fase móvel constituída por um solvente não polar em estado líquido.

As substâncias polares presentes em uma mistura de substâncias interagem com a fase estacionária polar e são adsorvidas por este. Além disso, eles têm pouca afinidade pelo solvente não polar da fase móvel.

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Enquanto isso, as substâncias de baixa polaridade são facilmente separadas de sua união com a fase estacionária devido à sua polaridade; o que lhes permite interagir em maior extensão com a fase móvel não polar e serem deslocados por ela.

Cromatografia partitora líquida-líquido

Este termo é usado para citar um tipo de cromatografia em que a fase estacionária e a fase móvel estão em um estado líquido. A fase estacionária é um líquido polar que permeia o suporte sólido, geralmente sílica inerte. E a fase móvel corresponde a um líquido não polar.

Esse arranjo de fase na cromatografia de partição é chamado de fase normal, enquanto que se o líquido não polar permear a sílica, constituindo a fase estacionária, será chamada de cromatografia de partição em fase reversa.

Cromatografia em troca iônica

Nesse tipo de cromatografia, a fase estacionária é carregada eletricamente. Quando seu ônus é positivo, ele retém os ânions (-); E se a carga for negativa, para os cátions (+).

Eles são frequentemente usados ​​como amina estacionária, ácido sulfônico, diatomoma, celulose e sefadex (obtido de Dextrano). Esses últimos materiais são adicionados uma carga positiva, por exemplo, dietilamineotil (DEAE) para obter a Deae-Celulose ou o Deae-Sefadex, para interagir com os ânions.

Eles também podem ser adicionados uma carga negativa por união do grupo carboximetil (CM), para formar CM-celulose ou CM-sefadex, que funcionam como trocadores catiônicos.

As interações eletrostáticas existentes nesse tipo de cromatografia podem ser reguladas por meio de modificações de pH e a força iônica do líquido que forma a fase móvel.

Um pH neutro ou básico, as proteínas geralmente são carregadas negativamente e interagem com a carga positiva da DEAE----gelulose e do Deae-sefadex; Mas, diminuindo o pH da fase móvel, as proteínas podem se tornar positivas e parar de interagir com a carga positiva da fase estacionária.

Usando esta estratégia experimental, você pode separar as diferentes proteínas presentes em uma mistura.

Eles também são usados ​​em compostos inorgânicos de cromatografia em troca iônica, como aluminilicatos (zeólitos).

Cromatografia de exclusão de tamanho

Esse tipo de cromatografia é baseado na existência de partículas que os canais presentes no interior, que permitem a circulação de uma substância de tamanho pequeno e baixo peso molecular através deles. Enquanto isso, substâncias maiores não podem atravessar os canais e são excluídas deles.

Embora pareça estranho, substâncias maiores se movem pela fase móvel mais facilmente do que as de tamanho menor, pois não são retidas nos canais das partículas usadas na cromatografia. Entre essas partículas estão o zeólito e o Sepaadex.

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O So -chamado Sepadex foi criado pela empresa Pharmacia a partir do polissacarídeo Dextran. Existem muitos tipos de sefadex cujo uso é selecionado com base no tamanho ou peso molecular das substâncias desejadas para separar.

Cromatografia em fase gasosa

Nesta cromatografia, a fase estacionária cobre a parede das colunas ou preenche seu interior, enquanto a fase móvel é um gás inerte: nitrogênio ou hélio. As colunas da cromatografia são feitas de vidro ou metal; Embora atualmente tenham formas estreitas de capilares, cujas paredes são revestidas com sílica.

As colunas de cromatografia têm um comprimento entre 1 metro e 100 metros, sendo as colunas dentro de um forno capaz de fornecer temperaturas superiores a 300 ° C. As substâncias usadas na cromatografia devem ser voláteis, pois devem evaporar durante a cromatografia.

As substâncias evaporam da superfície da fase estacionária de acordo com seu ponto de ebulição. A evaporação de substâncias ocorre dependendo do aumento da temperatura do forno, permitindo que as substâncias atinjam seu ponto de ebulição sequencialmente.

Uma vez atingido seu ponto de ebulição, as substâncias evaporam e são arrastadas pela corrente de gás inerte para o sistema de detecção e análise.

A técnica de cromatografia gasosa é basicamente analítica e não preparativa. Isto é, geralmente não é usado para obter uma certa substância.

Cromatografia de alta resolução (HPLC)

As fundações da HPLC são semelhantes às chamadas de coluna ou cromatografia de adsorção, mas a diferença é que o solvente (fase móvel) passa pela fase estacionária, acionada por uma pressão de cerca de 400 atmosferas.

As colunas HPLC têm um comprimento entre 15 e 25 cm e um diâmetro interno de 0.46 cm. Eles geralmente são feitos de aço inoxidável. A fase estacionária é formada por partículas de sílica muito pequenas que têm um recurso polar.

Fase normal

Na fase HPLC normal, um solvente não polar é geralmente usado como fase móvel, geralmente hexano. Substâncias polares interagem com sílica e trigial emergem de colunas de cromatografia. Enquanto isso, substâncias não polares têm maior afinidade por solventes não polares, eles não interagem com partículas de sílica e, portanto, emergem rapidamente das colunas.

Fase reversa

Na fase reversa reversa assim, as partículas de sílica polar são transformadas em não polar pela adição de uma cadeia de hidrocarbonetos de 8 a 18 carbonos. Na fase móvel, um solvente polar formado por uma mistura de metanol e água é usado.

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Substâncias polares não interagem com partículas de sílica modificadas (não polares), mas interagem com o solvente polar, permitindo que eles saam rapidamente da coluna de cromatografia, sendo levados para um sistema de detecção com a presença de luz ultravioleta.

Cromatografia de afinidade

Essa cromatografia é baseada na interação de uma substância específica com um ligante para ela, fixada em um suporte que pode ser ágeo, dextrano, celulose, etc. A cromatografia de afinidade é uma técnica usada para a separação e purificação de moléculas com uma função biológica.

A técnica de cromatografia de afinidade permite a purificação de uma proteína, usando um anticorpo específico fixado a um suporte, que constitui a fase estacionária. Cobre, cobalto e níquel são usados ​​como ligante para obter proteínas que contêm o aminoácido histidina.

Essa técnica para purificação de DNA e RNA também é usada, usando um ácido nucleico com uma sequência de base complementares. A substância ligada ao seu ligante pode ser separada modificando o pH ou a força iônica da solução usada como uma fase móvel.

Formulários

A cromatografia em coluna é uma técnica usada para a separação de uma substância de uma mistura deles, para diferentes fins ou objetivos. Por exemplo: o diagnóstico de um problema, a identificação de medicamentos, a obtenção de uma substância, etc.

A cromatografia de adsorção é usada na eliminação de impurezas de substâncias, no isolamento de metabólitos de fluidos biológicos, em determinação em alimentos de ácidos orgânicos nocivos, etc.

A cromatografia líquida de alta resolução é uma técnica que possui numerosos usos, incluindo: na detecção de antibióticos, sedativos, esteróides ou outro interesse farmacológico; Na identificação de agentes poluentes, como pesticidas, herbicidas, fenóis, etc.

A cromatografia gasosa é usada no estudo de muitas substâncias voláteis. É usado na indústria farmacêutica em análise de medicamentos, como aspirina, ibuprofeno e paracetamol. Além da identificação na urina de agentes de doping, como anfetaminas, cocaína, LSD, cannabis, etc.

A cromatografia de exclusão de tamanho e a cromatografia de afinidade são usadas principalmente no isolamento e purificação de macromoléculas biológicas, como proteínas e ácidos nucleicos.

E, finalmente, a cromatografia de troca iônica é usada na purificação de proteínas e polipeptídeos.

Referências

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