Fundação, preparação e uso de tampão de fosfato (PBS)

Ele tampão fosfato, BPS ou tampão de fosfato salina É uma solução tampão e isotônica, cuja função é manter o pH e a pressão osmótica a mais próxima do ambiente ambiental (fisiológico) natural (fisiológico). O acrônimo PBS significa solução salina tamponada com fosfato.

PH e osmolaridade são dois aspectos muito importantes que devem ser controlados em determinados protocolos de laboratório. No caso do pH, é essencial que ele seja controlado, especialmente em reações bioquímicas, uma vez que elas podem variar ou não executar se os reagentes estiverem em um pH inadequado.

Tampão salino pbs fosfato em dois pH diferentes. Fonte: Pixinio.com

Enquanto, o controle da osmolaridade é essencial, especialmente ao trabalhar com células vivas, uma vez que as membranas plasmáticas das células reagem de acordo com a concentração de solutos nos quais são encontrados.

Se as células forem transferidas para um meio hipertônico, elas desidratarão, uma vez que o gradiente de água será transportado para o lado, onde há uma maior concentração de solutos. Se, pelo contrário, as células forem colocadas em um meio hipotônico, as células absorverão o fluido até mentir.

É por isso que o tampão PBS para protocolos de laboratório que requerem manutenção celular é usado Em vitro, Dessa maneira, as células não serão danificadas.

PBS é composto por uma combinação de sais, como cloreto de sódio, fosfato de sódio, cloreto de potássio e fosfato de potássio. A composição PBS pode variar dependendo do protocolo.

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Base

Basicamente, a função do tampão fosfato salino é manter um pH fisiológico constante ao lado de uma concentração eletrolítica semelhante à dentro do organismo.

Nesse ambiente, as células são capazes de permanecer estáveis, pois as condições fisiológicas simulam o máximo possível.

Para a formulação PBS original, outros compostos de serem necessários podem ser adicionados, por exemplo, a adição de EDTA ao buffer é útil para lavagem de glóbulos vermelhos no teste de incompatibilidade cruzada.

O EDTA impede a fração do complemento C1 presente no soro, para dividir e lises aos glóbulos vermelhos, ou seja, evitar resultados falsos de incompatibilidade. Além disso, o EDTA ajuda a dissociar células.

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Preparação

A quantidade de sais que devem ser pesados ​​para a elaboração do PBS fosfato salino dependerá da quantidade necessária para se preparar:

-Solução de solução Salino phfosfato (PBS 10X)

Para um litro de solução:

Pesar:

80,6 g de NaCl,

2,2 g de KCl,

11,5 g de NA₂HPO₄,

2,0 g de KH₂HPO₄

Técnica de preparação

Em um copo, coloque os sais pesados, adicione água suficiente (80%) e misture na placa de agitação com barra magnética até que os sais se dissolvem.

Preparação de PBS usando ferro agitador com barra magnética . Fonte: Usuário: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtrar para remover partículas desenfreadas. Use filtros com poros de 0,45 µm. Esterilice de autoclave e distribui assepticamente em sino de fluxo laminar em potes de vidro com tampa.

Para a solução 10x (concentrada) não ajusta o pH. O ajuste é feito uma vez diluído para a concentração de tampão PBS 1x (diluição 1:10).

-Tampão fosfato salino (PBS 1x)

PBS 1X pode ser preparado diretamente, pesando as quantidades correspondentes de cada sal ou pode preparar diluindo a solução mãe (1:10) com água destilada estéril.

-Para preparar diretamente um litro de fosfato salino PBS 1x arrependimento:

8,06 g de NaCl,

0,22 g de KCl,

1,15 g de NA₂HPO₄,

0,20 g de KH₂HPO₄

Técnica de preparação

Prosseguir conforme explicado na solução concentrada. Posteriormente, o pH deve ser ajustado. Para fazer isso, meça o pH e, dependendo do resultado, use ácido (HCl) ou base (NaOH) para diminuir ou carregar o pH, respectivamente, conforme necessário, até que seja 7.4.

O ácido ou a base é adicionado queda por gota durante o monitoramento do valor de pH da solução usando um medidor de pH. Filtrar, esterilice de autoclave e distribuir assepticamente em tubos cônicos ou garrafas conforme necessário.

-Para preparar o PBS 1X da solução mãe 10x:

Fazer uma diluição 1:10. Por exemplo, para preparar 1 litro de PBS 1x, meça 100 ml da solução mãe e adicione 700 ml de água destilada estéril. Ajuste o pH e complete a quantidade de água até atingir 1000 ml.

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O tampão PBS preparado é incolor e transparente.

PBs de uso diário podem ser armazenados à temperatura ambiente e o restante na geladeira.

.Soluções para configuração de pH

Hcl

Para 100 ml de HCl (ácido clorídrico) a 1 molar.

Meça 91 ml de água destilada e coloque -a em um vaso precipitado de 250 ml de capacidade.

Meça 8,62 ml de HCl concentrado e adicione -o lentamente ao copo que contém a água (nunca o faz de cabeça para baixo). Tome medidas relevantes de biossegurança ao lidar com ácidos fortes (substância altamente corrosiva).

Misture por 5 minutos usando uma placa de agitação com uma barra magnética dentro do vidro. Vá para uma bola de 100 ml e corada a 100 ml com H₂Ou destilado.

Naoh

Para 100 ml de NaOH (hidróxido de sódio) 10 molares.

Meça 40 ml de água destilada e coloque -a em um copo de capacidade de 250 ml. Meça 40 gr de NaOH e adicione à água. Misture usando uma placa de agitação com uma barra magnética dentro do vidro.

Vá para uma bola aggroid de 100 ml e nivelada com água destilada. Cumprir os padrões de biossegurança, porque essa reação é exotérmica (libera energia na forma de calor).

Se você deseja preparar outras quantidades de solução de fosfato salina, consulte a tabela a seguir:

Fonte: "Laboratório de genômica viral e humana, Escola de Medicina UASLP"

Formulários

Principalmente é usado em laboratórios de biologia celular, imunologia, imuno -histoquímica, bacteriologia, virologia e pesquisa.

É ideal fazer a lavagem celular por centrifugado (glóbulos vermelhos), monocapas celulares lavadas, em técnicas espectroscópicas de elipsometria, na quantificação de biofilmes bacterianos, na manutenção de culturas celulares para vírus, como uma solução de lavagem na técnica de indireta imunofluorescência e em técnicas para a caracterização de anticorpos monoclonais.

Também serve para transportar células ou tecidos, como diluente para a contagem de células, a preparação de enzimas celulares (Tripsin), como um diluente do método de dessecação de biomoléculas e para preparar outros reagentes.

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Por outro lado, Martin e colaboradores em 2006 mostraram que a PBS é útil em laboratórios de ciências forenses, especificamente na recuperação de espermatozóides do esfregaço vaginal ou na recuperação de células vaginais de espuma peniana. Dessa forma, pode ser estabelecido se houve um relacionamento sexual.

Limitações

-Algum tampão PBS traz como conservante uma substância chamada Azid de sódio. Este composto pode gerar substâncias explosivas se entrar em contato com chumbo ou cobre. Por esse motivo, os cuidados especiais devem ser tomados ao descartar este reagente para a drenagem. Se descartado por esta rota, a água abundante deve ser adicionada para diluir ao máximo.

-O tampão fosfato não deve ser adicionado zinco, pois precipita alguns sais.

-Wangen e colaboradores em 2018 determinaram que o uso de PBS não era adequado para a lavagem de leucemia mielóide aguda primária (AML) extraída do sangue periférico, porque muitas células são perdidas pela lise, com uma grande diminuição no material da proteína.

Portanto, eles determinaram que as células primárias da AML não deveriam ser lavadas com PBS após o armazenamento em nitrogênio líquido.

Referências

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