Ágar de sangue

Uma abordagem de sangue. Com licença

O que é ágar de sangue?

Ele Ágar de sangue É um meio de cultura sólido enriquecido, usado para a recuperação e crescimento de uma ampla variedade de microorganismos de amostras clínicas ou subjetivas.

Este meio de cultura é basicamente composto por um ágar base enriquecido e 5% de sangue de ovelha. A base de ágar pode variar de acordo com as necessidades, mas principalmente será composta por peptonas, aminoácidos, vitaminas, extrato de carne, cloreto de sódio, ágar, entre outros. Quanto ao sangue, o sangue humano às vezes é usado.

A coleta de sangue pode ser preparada em laboratório ou já pode ser comprada, de empresas dedicadas a ele. A preparação deste meio é muito delicada, qualquer descuido em sua elaboração resultará em um lote contaminado.

Portanto, todas as precauções possíveis devem ser tomadas e, no final.

Base

Staphylococcus aureus cultivado em ágar de sangue. Fonte: Nathan Reading on Flickr Nathan R. No Twitter, Wikimedia Commons

O ágar de sangue é um meio enriquecido, diferencial e não -seletivo. 

• É um meio enriquecido porque carrega como um aditivo principal de 5 a 10% de sangue em uma base de ágar. Ambos os compostos contêm muitos nutrientes que permitem que a maioria das bactérias cultiváveis ​​cresça nele.
• Esse crescimento ocorre sem restrição, por isso não é seletivo. No entanto, se forem adicionados compostos que impedem o crescimento de alguns microorganismos e favorecem os de outros, isso se seletivo. Por exemplo, se certos tipos de antibióticos ou antifúngicos forem adicionados.
• É diferencial, pois permite distinguir 3 tipos de bactérias: beta-hemolítica, alfa-hemolítica e gama-hemolítica.
• Beta-hemolítico são aqueles que têm a capacidade de lisar ou completar. Exemplos de bactérias ß-hemolíticas são Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae.
• Alfa-hemolítico são aqueles que realizam hemólise parcial, onde a hemoglobina é oxidada para a metaglobina, gerando uma coloração esverdeada ao redor das colônias. Esse fenômeno é conhecido como hemólise α ou α-hemólise, e as bactérias são classificadas como α-hemolíticas. Exemplo de bactérias α-hemolíticas são Streptococcus pneumoniae e Streptococcus do grupo Viridans.
• As bactérias gama-hemolíticas ou não-hemolíticas crescem em relação ao ágar sem gerar mudanças nele, um efeito conhecido como γ-hemólise, e o microorganismo são γ-hemolíticos. Exemplo de bactérias γ-hemolíticas: algumas cepas de Streptococcus do Grupo D (Streptococcus bovis e Enterococcus faecalis).

Formulários

• Este meio de cultura é um dos mais usados ​​no laboratório de microbiologia. Entre os microorganismos capazes de crescer neste meio, estão: bactérias rigorosas, opcionais, microaerofílicas, anaeróbicas, gram -positivas ou negativas, bactérias rápidas ou crescimento lento ou crescimento lento.
• Algumas bactérias exigentes ou irritantes também crescem do ponto de vista nutricional, bem como fungos e leveduras. É útil para cepas subjetivas ou reativadoras que são metabolicamente muito fracas.

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No entanto, a escolha da agência de sangue e base variará dependendo do microorganismo que provavelmente se recuperará e do uso que será dado à placa (cultivo ou antibiograma).

Escolha do tipo sanguíneo

O sangue pode ser de cordeiro, coelho, cavalo ou humano.

O mais recomendado é o sangue de cordeiro, exceto por algumas exceções. Por exemplo, para isolar espécies de Haemophilus, onde o sangue recomendado é cavalo ou coelho, já que o sangue de cordeiro tem enzimas que inibem o fator V.

O menos recomendado é o humano, embora seja o mais usado, talvez porque seja o mais fácil de obter. 

O sangue deve ser desfibrado, obtido sem nenhum aditivo e de animais saudáveis. Para o uso do sangue humano, vários fatores devem ser lembrados:

• Se o sangue vier de indivíduos que sofreram infecções bacterianas, eles possuirão anticorpos específicos. Nessas condições, é provável que o crescimento de algumas bactérias seja inibido.
• Se obtido do banco de sangue, ele contém citrato e é possível que certas bactérias não se desenvolvam em sua presença.
• Se o sangue vem de pacientes que estão tomando antibióticos, o crescimento de bactérias suscetíveis pode ser inibido.
• E se o sangue é de uma pessoa diabética, o excesso de glicose interfere nos padrões de hemólise que desenvolvem adequadamente.

Escolha da taxa básica

Ágar base usado para a preparação do ágar sanguíneo pode ser muito amplo. Entre eles estão: ágar nutriente, infusão de coração cerebro, soja tríptica, Müeller Hinton, Thayer Martin, Agar Columbia, ágar Brucella, ágar Campylobacter, etc.

Usos do ágar sanguíneo de acordo com o meio base usado para preparação

Ágar nutriente

Esta base é a menos usada, porque eles crescerão principalmente bactérias não querem que os bactérias, como bacilos entéricos, Pseudomonas sp, S. Aureus, Bacillus sp, entre outros. Não é recomendado isolar Streptococcus.

Cerebro Heart Infusion (BHI)

É um dos mais utilizados como base, porque possui os nutrientes necessários para o crescimento da maioria das bactérias, incluindo Streptococcus sp e outras bactérias exigentes. Embora não seja apropriado observar padrões de hemólise.

Com esta base, o sangue de cordeiro é usado.

Você também pode preparar variantes de ágar no sangue, onde outros compostos são adicionados para isolar certos microorganismos. Por exemplo, a infusão Cerebro Heart suplementada com sangue de coelho, cistina e glicose, serve para isolar Francisella tularensis.

Enquanto, com Cistina Telurito, é útil isolar Corynebacterium difteriae. Sangue humano ou cordeiro pode ser usado.

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Com o primeiro, a trimólise beta será vista como um halo estreito, enquanto com o segundo o halo será muito mais amplo.

Esta base, juntamente com bacitracina, amido de milho, sangue de cavalo e outros suplementos de enriquecimento (Isovalex), é usado para isolamento de gênero Haemophilus sp De amostras respiratórias.

Se a combinação de antibióticos de cloranfenicol-gentamicina ou penicilina-estuffyina com sangue de cavalo é adicionado, serve para isolar fungos patogênicos exigentes, mesmo com um desempenho mais alto ao ágar de glucose de Sabouraud. Especialmente é útil em isolamento de Histoplasma capsulatum.

Agar de soja tripTyse

Esta base é a mais recomendada para observar melhor o padrão de hemólise e a realização de testes de diagnóstico, como opto -corner e impostos sobre bacitracina. É o ágar clássico de sangue usado pela rotina.

Com esta base, você também pode preparar o ágar de sangue especial para Corynebacterium difteriae, Com Telurito Cistina e sangue de cordeiro.

A combinação desse sangue de ágar, mais canamicina-vancomicina, é ideal para um crescimento anaeróbico, especialmente Bacteroides sp.

Müeller Hinton Agar

Esta base suplementada com sangue é usada para realizar o antibiograma de microorganismos exigentes, como Streptococcus sp. Também é útil para isolar bactérias como Legionel Pneumophila.

Thayer Martin Agar

Este meio é ideal como uma base de ágar no sangue quando suspeita do gênero Neisseria, especialmente Neisseria meningitidis, já que N. Gonorrhoeae Não cresce em ágar de sangue. Também serve para realizar testes de suscetibilidade a Neisseria meningitidis.

Agar Columbia

Esta base é excelente para semear amostras de biópsias gástricas em busca de Helicobacter pylori.

O meio está preparando 7% do sangue de cordeiro desfibrinado com antibióticos (vancomicina, trimetoprim, anfotericina B e cefsulodina) para restringir o crescimento de outros tipos de bactérias que podem estar presentes.

Essa mesma base suplementada com sangue humano ou cordeiro, nalidíxico e ácido de colistina são úteis para isolar Gardnerella vaginalis. Também é ideal avaliar a suscetibilidade antimicrobiana a antibióticos do mesmo microorganismo.

Além disso, serve para a preparação de ágar de sangue para o cultivo anaeróbico, adicionando aminoglicosídeos e vancomicina. Esta base nos permite observar padrões de hemólise adequadamente.

Agar Brucella

Este meio usado como base de agência de sangue, juntamente com a adição de vitamina K, é ideal para o cultivo de bactérias anaeróbicas. Nesse caso, o uso de sangue de cordeiro é recomendado.

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Agar Campylobacter

Agar Campylobacter suplementado com sangue de RAM a 5% e 5 antibióticos (cefalotina, anfotericina B, trimetoprim Campylobacter jejuni Em amostras de fezes.

Preparação

Cada casa comercial traz ao contrário da embalagem as indicações para preparar um litro de meio de cultura. Os cálculos correspondentes podem ser feitos para preparar o valor desejado, de acordo com o ágar base selecionado.

Pesar e dissolver

O ágar base é desidratado (em poeira), portanto, deve ser dissolvido em água destilada ajustada ao pH 7.3.

A quantidade indicada pelo ágar base escolhida é pesada e dissolvida na quantidade correspondente de água em uma fixola, então é aquecida em fogo moderado e mistura com movimentos rotativos até que toda a poeira.

Esterilizar

Uma vez dissolvido, esterilize em autoclave a 121 ° C por 20 minutos.

Agregado sanguíneo

Ao sair da autoclave, a fixola será resfriada até que a temperatura varia entre 40 e 50 ° C. É uma temperatura que suporta a pele humana e, ao mesmo tempo, o ágar ainda não solidificou.

Para fazer isso, o Fixola é tocado com a mão e, se o calor for tolerável, é a temperatura ideal para adicionar o sangue desfibrinado correspondente (50 ml por litro de ágar). Misture para homogeneizar.

A passagem do agregado do sangue é crucial, porque se for feito quando o meio estiver muito quente, os glóbulos vermelhos quebrarão e o meio não servirá para observar a hemólise.

Se for adicionado muito frio, os caroços serão formados e a superfície do meio não será suave para poder fazer o estriado corretamente.

Despeje nos pratos de Petri

Sirva em placas estéreis de Petri imediatamente após homogeneizar sangue. Em cada placa de Petri, aproximadamente 20 ml é derramada. Este procedimento é realizado em um sino de fluxo laminar ou perto do isqueiro.

No momento de servir sangue nas placas de Petri, as bolhas de ar não devem ser deixadas na superfície da placa. Se isso acontecer, a chama do isqueiro de Bunsen é passada rapidamente no prato para removê -los.

As placas podem solidificar e são armazenadas na geladeira (2-8 ° C) invertidas até o uso. Antes de usar placas de ágar no sangue, eles devem estar temperando para poder semear.

As placas preparadas têm uma duração aproximada de 1 semana.

Referências

1. Bayona, m. Condições microbiológicas para o cultivo de Helicobacter pylori. Rev. Repolho. Gastroenterol. 
2. Forbes, B ,, Sahm, D., Weissfeld, a. Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. Pan -American Editorial S.PARA.