Agar Count Standard Foundation, preparação e usos

Ele Agar padrão É um meio de cultura sólido e não seletivo, projetado para a quantificação da carga microbiana aeróbica presente nas águas do consumidor, águas residuais, bebidas leiteiras, entre outros alimentos. Este meio também é conhecido como Agar PCA) por seu acrônimo em inglês Count Agar. Foi criado em 1953 por Buchbinder, Baris e Goldstein.

O meio de conta padrão é composto de extrato de levedura, tripta, glicose, ágar e água destilada. Esta formulação contém elementos básicos nutricionais que permitem o desenvolvimento do presente e exigindo carga microbiana aeróbica.

Diluições decimais para a contagem padrão de contagem do UFC. Fonte: Quentin Geissmann [CC BY-SA 3.0 (https: // CreativeCommons.Org/licenças/BY-SA/3.0)]

Como o meio não contém inibidores, as bactérias podem se desenvolver sem restrições, por isso é ideal para a contagem de colônias gerais. No entanto, a técnica de quantificação da placa não detectará todas as bactérias presentes, mas apenas aquelas que são capazes de crescer sob as condições ambientais às quais o ágar é submetido.

Nesse sentido, a técnica de quantificação da placa é geralmente determinada pela quantidade de bactérias do tipo mesofilo aeróbico, ou seja, aquelas que são desenvolvidas em temperaturas entre 25 e 40 ° C, com uma temperatura de crescimento ideal a 37 ° C.

Este grupo bacteriano é muito importante, porque existem mais bactérias patogênicas para o homem.

Deve -se notar que às vezes o interesse quantifica a quantidade de bactérias psicrofílicas presentes em alimentos. Essas bactérias são aquelas que se desenvolvem em baixas temperaturas (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Da mesma forma, bactérias termofílicas, que se desenvolvem em uma faixa entre 50 ° C a 80 ° C ou mais, podem ser importantes em certos tipos de alimentos, como enlatados.

A quantificação microbiana é expressa em unidades de formação de cólon (UFC) por grama ou mililitro de amostra.

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Base

A conta padrão foi projetada para permitir o desenvolvimento satisfatório de bactérias aeróbicas não compensadoras, uma vez que o extrato de levedura, a tripta e a glicose fornecem os nutrientes necessários para um bom desenvolvimento microbiano.

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Por outro lado, o meio tem uma cor clara e uma aparência transparente, por isso é ideal para a visualização das colônias desenvolvidas pelo método semeado (derramamento de placa).

Também é possível a contagem de colônias pelo método plantado de superfície com drigalski espátula.

Quando a carga microbiana é alta, as diluições decimais da amostra em estudo devem ser feitas para poder executar a contagem do UFC.

Deve -se notar que este meio é recomendado pela American Public Health Association (APHA) para a contagem de mesofilos aeróbicos.

Preparação

Pese 23,5 gr do meio desidratado e se dissolve em um litro de água destilada. Para dissolver completamente a mistura deve ser aquecida acenando com frequência até ferver. As etapas a seguir dependem da técnica plantada que será usada.

Para a técnica de dumping de placas

Distribuir dando 12 a 15 ml em tubos de teste. Posteriormente, esterilize em autoclave a 121 ° C por 15 minutos. Deixe solidificar verticalmente na forma de um taco. Salve até uso.

Derreta o taco quando for usado. Depois de mantê-lo em Maria a 44-47 ° C enquanto as amostras são preparadas.

Para a superfície semeada

Esterilize o meio em autoclave a 121 ° C e depois distribua 20 ml em placas estéreis de Petri. Deixe solidificar, investir e salvar na geladeira até usar.

Tempere as placas antes de usar. O pH médio deve ser de 7,0 ± 0,2.

Usar

A conta padrão é usada na técnica de contagem mesofílica aeróbica durante a análise microbiológica de água e alimentos. A conta dos mesofilos aeróbicos é necessária, pois determina a qualidade da saúde da amostra em estudo.

A aplicação desta técnica (usando este meio) permite a visualização macroscópica de colônias isoladas para quantificação.

Técnica de descarga de placa (semeada com profundidade)

-Procedimento

A técnica consiste no seguinte:

1) homogeneizar a amostra para redistribuir as bactérias presentes.

2) Uma suspensão inicial é realizada em uma garrafa ou bolsa estéril, respeitando a proporção de 10 gr ou 10 ml em 90 ml de diluente (10^-1).

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3) A partir da suspensão inicial, as diluições decimais relevantes são feitas dependendo do tipo de amostra. Ex: (10^-2, 10^-3, 10^-4). As diluições são realizadas com a solução tampão de água ou fosfato peptonada ou fosfato.

Por esta^-2 e assim por diante.

4) 1 ml de cada diluição é tomado e colocado em placas de Petrie estéril vazias.

5) Adicione a cada placa de 12 a 15 ml de ágar anteriormente fundido e descansado a 44 - 47 ° C.

6) Dê movimentos rotativos suaves nas placas para distribuir a amostra ao lado do ágar uniformemente e deixe solidificar.

7) Invista as placas e incubar a 37 ° C na aerobiose por 24 a 48 horas.

8) culminou o tempo passa a examinar as placas e contar as colônias na diluição que o permite. As placas que têm entre 30 a 300 UFC são escolhidas para a conta.

A contagem pode ser feita manual ou pode usar a equipe de contador de colônias.

Os valores permitidos pelo ML da amostra podem variar de um país para outro de acordo com as regras pelas quais eles são governados.

-Cálculo do UFC

O cálculo geral é feito usando a seguinte fórmula:

Fórmula para o cálculo geral da quantificação do UFC. Fonte: Administração Nacional de Medicamentos e Tecnologia Médica (ANMAT). Análise microbiológica de alimentos, metodologia analítica oficial, microorganismos indicadores. 2014 Volume 3. Disponível em: Anmat.Gov.ar

Expressar os resultados em 1 ou 2 dígitos, multiplicando pela base apropriada 10. Exemplo: se o resultado for 16.545 é arredondado com base no terceiro dígito aos 17.000 e será expresso da seguinte forma: 1,7 x 10⁴. Agora, se o resultado fosse 16.436 é arredondado para 16.000 e expressa 1.6 x 10⁴.

Técnica de semeada de superfície

-Procedimento

-Inocular com 0,1 ml da amostra direta se for líquido, suspensão inicial 10^-1 ou de diluições consecutivas 10^-2, 10^-3 etc, no centro de uma placa de conta padrão.

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-Distribua a amostra com drigalski espátula ou haste de vidro na forma de L. Deixe repousar por 10 minutos.

-Invista as placas e incubar a aerobiose a 37 ° C por 24 a 48 horas.

-Prossiga para contar as colônias, escolha as placas que estão em uma faixa entre 20 e 250 UFC.

-Cálculo do UFC

Para o cálculo, o fator de diluição é aplicado, que é o inverso. O número de 2 dígitos significativos é arredondado (arredondando de acordo com o terceiro dígito) e é expresso no poder da base 10. Por exemplo, se 224 UFC forem contados na amostra sem diluição (10^-1), 22 x 10 é relatado¹  UFC, mas se o número for 225, é relatado 23 x 10¹ Ufc.

Agora, se 199 UFC for contado na diluição 10^-3, 20 x 10 serão relatados⁴ UFC, mas se 153 UFC forem contados na mesma diluição será relatado 15 x 10⁴ Ufc.

Controle de qualidade

O meio de conta padrão pode ser avaliado usando cepas conhecidas certificadas, como: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella Flexneri ATCC 12022.

Se o meio de cultura estiver em condições ideais, o crescimento satisfatório é esperado em todos os casos, com exceção de eu. Fermentum que pode ter desempenho regular.

Para avaliar a esterilidade do meio de cultura, uma ou duas placas de cada lote preparado (sem inocular) a 37 ° C na aerobiose por 24 horas devem ser incubadas. Após esse período, nenhuma mudança de crescimento ou cor do meio deve ser observada.

Limitações

-Não derreta o ágar mais de uma vez.

-O meio preparado pode durar até 3 meses, desde que permaneça em uma geladeira e protegido da luz.

-Este meio não é adequado para exigir microorganismos, ou anaeróbios.

Referências

1. Administração Nacional de Medicamentos Alimentos e Tecnologia Médica (ANMAT). Análise microbiológica de alimentos, metodologia analítica oficial, microorganismos indicadores. 2014 Volume 3. Disponível em: Anmat.Gov.ar
2. Laboratórios Diffco Francisco Soria Melguizo, S.PARA. Agar contagem de placas. 2009. Disponível em: http: // f-soria.é
3. Laboratórios de Conde Pronadisa. Agar para métodos padrão (PCA) de acordo com a APHA e ISO 4833. Disponível em: Condalab.com
4. Laboratórios da Britânia. Contagem de placas de ágar. 2015. Disponível em: Britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegon A, Palao M, Serrano B e Velázquez ou. 2009. Técnicas para análise microbiológica alimentar. 2ª ed. Faculdade de Química, UNAM. México. Disponível em: DePa.Fquim.Unam