Método de Bradford O que é, princípio, reagentes, usa

Ele Método de Bradford É um método colorimétrico atualmente usado para estimativa rápida da concentração total de proteínas em amostras de experimentação biológica. É usado em vários campos de pesquisa biológica, médica, veterinária, agronômica, etc.

É conhecido como "Método de Bradford" porque foi descrito pela primeira vez por Marion Bradford em 1976, em sua publicação intitulada Um método rápido e sensível para a quantificação de proteínas em quantidades de microgramas usando o princípio da União Proteína-Youth.

Fotografia de uma placa Elisa, onde as amostras se prepararam para uma quantificação de Bradford (Fonte: Helito, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Desde sua proposta, esse método tem sido popularmente popularizado, pois é reconhecido mais sensível do que outros métodos de quantificação de proteínas (como Lowry e Biuret, por exemplo); forma complexa mais estável e é econômico e fácil de realizar.

Além disso, foi demonstrado que os reagentes que eles usam têm muito pouca interferência em medições espectrofotométricas em diferentes condições.

[TOC]

Princípio do método

O método de Bradford é baseado na quantificação de mudanças de cor em uma solução devido à união - em condições ácidas - das moléculas de proteína de uma amostra com as moléculas de um corante especial: Coomassie Blue Azul brilhante G250.

Quando esse corante é adicionado a uma solução de proteína, ele se liga a essas moléculas através das forças eletrostáticas e essa reação é evidenciada como uma mudança de cor marrom avermelhada para azul para azul.

Proteínas e aminoácidos

Assim como o corpo é formado por muitas células e ácidos nucleicos (como DNA e RNA) são formados por nucleotídeos, as proteínas são formadas por sequências ordenadas de algumas moléculas conhecidas como aminoácidos.

Um aminoácido é uma molécula composta por um átomo de carbono central ao qual 4 grupos químicos diferentes são unidos: um átomo de hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo ou cadeia lateral, que fornece a identidade.

Existem 20 aminoácidos comuns para todas as proteínas, que diferem entre si em relação às propriedades de seus grupos paralelos: existem aminoácidos básicos, ácidos, polares, apolares, cíclicos, aromáticos, etc.

Pode servir a você: Lei de Tolerância de Shelford: o que são e exemplos

A soma das características desses aminoácidos e a ordem em que se juntam para formar a estrutura da proteína fornece a cada proteína uma série de características físico -químicas específicas, seja em relação à sua carga, sua massa, sua hidrofobicidade, entre outros.

Complexo de Tint-Proteínas

O método de Bradford, então, quantifica a presença de resíduos de aminoácidos de características básicas em amostras biológicas, particularmente aminoácidos como arginina, lisina e histidina, que são os que são mais facilmente acomodados com Coomassie Blue.

As alterações de cor são quantificadas como variações na absorvância das amostras, que são medidas usando um espectrofotômetro ajustado a um comprimento de onda de 595 nm.

O que é absorvância?

Também é conhecido como densidade óptica e define a quantidade de luz que é absorvida por uma solução. Essa absorção depende do comprimento de onda da luz usada para irradiar a solução, uma vez que nem todas as moléculas são capazes de absorver o mesmo comprimento de onda.

Esse fenômeno foi resumido em uma lei conhecida como Lei de Beer-Lambert, que estabelece a relação entre a diminuição da quantidade de luz que passa por uma substância e as propriedades da referida substância.

Por ejemplo, cuando una luz es transmitida a través de una solución se tienen dos medidas de intensidad: una intensidad incidente (antes de atravesar la solución) y una intensidad transmitida (generalmente menor, que corresponde a la fracción de luz que no fue absorbida por a solução).

A relação entre ambos os valores é o que é conhecido como processamento e tem valores entre 0 e 1 ou é expresso em termos percentuais.

A absorvância está relacionada ao processamento da maneira logarítmica, e a lei de Beer-Lambert propõe uma relação linear entre a absorvância de uma solução e sua concentração, seu coeficiente de extinção molar e o coeficiente óptico da solução; A equação matemática que descreve esta lei é a seguinte:

Pode atendê -lo: fauna nociva: causas de proliferação, consequências, controle

A (absorvância) = ε (coeficiente de extinção molar) C (concentração) L (comprimento do passe da luz)

A concentração de uma solução é calculada pela limpeza, disse a equação e executando os cálculos relevantes (c = a/εl)

O que é um espectrofotômetro?

É um dispositivo usado para quantificar a quantidade de luz (dependendo do comprimento de onda) que absorve as moléculas em uma solução ou, em outras palavras, a quantidade de luz que passam.

Os espectrofotômetros funcionam emitindo um feixe de luz (visível ou ultravioleta) que passa por um prisma (ou um dispositivo conhecido como Monocromador da rede de difração) isso quebra -o nos diferentes comprimentos de onda que compensam, permitindo "selecionar" um comprimento específico.

Essa luz é passada através de um tubo especial que contém a amostra que é analisada e subsequentemente atinge um detector que percebe a quantidade de luz que é transmitida a partir da referida amostra (que não foi absorvida) que pode ser observada posteriormente graças a um "interpreper" que tem uma interface gráfica.

O corante: Coomassie Blue Azul brilhante G 250

O reagente mais importante desse método é, sem dúvida, o corante usado para "marcar" as proteínas na amostra. Bradford propôs seu trabalho porque esse corante existe de duas maneiras: um vermelho e um azul. A forma vermelha se torna a forma azul quando o corante se liga a uma proteína, formando um complexo.

O complexo azul-proteína azul possui um coeficiente de extinção molar muito alto, resultando em maior sensibilidade para a quantificação da concentração de proteínas nas amostras analisadas.

Reagentes

Embora a solução usada para esse método de quantificação seja geralmente comercializada em recipientes fechados, já preparados -o “Bradford Reactive” -, os principais reagentes utilizados são:

- Coomassie Blue Azul brilhante G50 (0.01% w/v)

- Ácido fosfórico (8.5 % w/v)

- Etanol (4.7% w/v)

Kit de quantificação de proteínas pelo método de Bradford (Fonte: Vivo Rolfe, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons)

Como em qualquer método e protocolo de quantificação de proteínas por métodos espectrofotométricos, é necessário ter uma proteína "padrão" ou "padrão" para realizar um curva de calibração determinar os valores de absorvância relacionados a diferentes concentrações de proteína; Geralmente albumina sérica bovina é usada.

Pode atendê -lo: ágar de chocolate

O método consiste em misturar certos volumes das amostras problema com certos volumes do reagente de Bradford; Aguarde alguns minutos para a interação corante-proteína e a mudança de cor é evidente e subsequentemente medida e registre os valores de absorvância para executar cálculos subsequentes.

Usa/aplicações

O método de Bradford é um dos métodos de quantificação ou estimativa da concentração de proteína mais usada no mundo, principalmente devido ao seu baixo custo, à velocidade com que os resultados são obtidos, para a grande estabilidade entre a proteína e o corante usado, para sua reprodutibilidade e a interferência mínima que os componentes dos reagentes utilizados durante a medição têm.

O método é usado em centenas de diferentes aplicações científicas para a determinação de proteínas em diferentes contextos: fisiológicos, citológicos, imunológicos, clínicos, industriais (particularmente na indústria de alimentos), etc.

Experimentalmente, esse método é muito útil para:

• Monitore a quantidade de proteína contida nos volumes que são progressivamente obtidos de uma coluna cromatográfica (em colunas de afinidade, troca de íons, absorção, filtração em gel, entre outros) I).e. Analisar frações de protocolos de purificação de proteínas.
• Monitore a quantidade de proteína que é carregada em um gel para eletroforese.
• Estimar a quantidade de proteína obtida em um sistema de superexpressão.

Referências

1. Bonjoch, n. P., & Tamayo, P. R. (2001). Quantificação de conteúdo de proteínas pelo método de Bradford. No Manual de Técnicas de Ecofisiologia de Plantas (PP. 283-295). Springer, Dordrecht.
2. Bradford, m. M. (1976). Um método rápido e sensível para a quantificação de quantidades de microgramas de proteína usando a ligação principal do dia da proteína. Bioquímica Analítica, 72 (1-2), 248-254.
3. Kielkopf, c. eu., Bauer, w., & Urbatsch, eu. eu. (2020). Ensaio de Bradford para determinar a concentração de proteínas. Protocolos Cold Spring Harbor, 2020 (4), PDB-Prot102269.
4. Sapan, c. V., Lundblad, r. eu., & Price, n. C. (1999). Técnicas de ensaio de proteína colorimétrica. Biotecnologia e Bioquímica Aplicada, 29 (2), 99-108.
5. Walker, J. M. (Ed.). (mil novecentos e noventa e seis). O manual dos Protocolos de Proteínas (vol. mil novecentos e noventa e seis). Springer Science & Business Media.