Fundação Half Löwenstein-Jensen, Preparação e Uso

Ele Médio Löwenstein-Jensen É um meio sólido seletivo para o isolamento e desenvolvimento de bactérias do gênero Mycobacterium, como Mycobacterium tuberculosis, M. Avium, entre outros, com exceção das espécies leprae, que não é cultivável.

As bactérias do gênero Mycobacterium não crescem nos meios de cultura convencionais; portanto, era necessário projetar um meio especial para seu isolamento. O meio original foi criado por Löwenstein e então foi modificado por Jensen.

Half Löwenstein-Jensen com colônias de Mycobacterium tuberculosis. Fonte: Agarwal et al / Biomed Central Ltd., Cortesia da biblioteca de imagens de biologia

A modificação consistiu na eliminação do corante vermelho do Congo, substituindo -o por uma maior concentração de verde malaquita. Também alterou as concentrações de citrato de magnésio e fosfato monopotasic.

Atualmente, o meio de Löwenstein-Lose contém um amido de papate, asparragina, citrato magnético, fosfato monopo-fase, sulfato magnético, verde malaquita, ácido nalidículo, cicloheximida.

Micobactérias é normalmente isolado de sites que não são estéreis, como escarro, urina, abscessos, entre outros. Isso significa que a maioria das amostras conterá a microbiota usual da área, além do patógeno.

É por isso que o meio Löwenstein-Jensen contém uma série de inibidores em sua composição representada por verde malaquita, antibióticos e antifúngicos.

Além disso, amostras que vêm do local não estéril devem ser descontaminadas e neutralizadas antes de serem semeadas no meio de Löwenstein-Jensen.

[TOC]

Base

A presença de ovo e glicerina no meio Löwenstein-Jensen estimula o crescimento de micobactérias porque elas fornecem ácidos graxos e proteínas necessárias para o desenvolvimento desses microorganismos.

O meio Löwenstein-Jensen contém verde malaquita, que é um inibidor da microbiota que o acompanha. Mas também contém ácido nalidíxico (35 µg/ml), que inibe a microbiota gram -negativa, cicloheximida (400 µg/ml), que inibe saprófitos fungos e leveduras e linchamento (2µ/ml), que inibe a microbiografia.

Algumas casas comerciais preferem adicionar a seguinte combinação de antibióticos: Polymixina B 200.000 unidades/L, anfotericina B 10 mg/L, carbenicilina 50 mg/L e trimetoprima 10 mg/L.

Este meio não contém ágar; portanto, a solidificação do meio ocorre pela coagulação da albumina presente no ovo durante a esterilização.

Preparação

Pese 37,3 g do meio desidratado em 600 ml de água destilada que foi adicionada anteriormente 12 ml de glicerol. A mistura é aquecida, frequentemente mexendo até sua dissolução total. Autoclavar o meio a 121 ° C por 15 minutos.

Pode atendê -lo: os 12 estágios do desenvolvimento humano e suas características

Por outro lado, uma suspensão homogênea de 1000 ml de ovos frescos deve ser preparada em condições assépticas. Adicione a suspensão do ovo a 600 ml preparada a uma temperatura de 50 - 60 ° C, evitando bolhas de ar.

As soluções antibióticas também são adicionadas após a esterilização em autoclave.

Despeje o meio em tubos de teste estéreis com um plugue de rosca. Aqueça os tubos a 85 ° C por 45 minutos na posição inclinada.

A cor do meio preparado é a Aguamarine Green e pode apresentar pontos esbranquiçados para a presença de lipídios de ovos.

O pH médio deve ser de 7,2 ± 0,2

Salve os tubos da geladeira e protegido da luz direta até usar. Afundar antes de semear.

Há uma modificação do meio chamado "Modificação Gruft do Löwenstein Jensen". Isso contém os mesmos compostos que o meio clássico, mas RNA-5mg/100 ml é adicionado e, como inibidores, ele contém verde malaquita 0,025 g/100 ml, penicilina 50 u/ml e nalidíxico 35 g/ml ácido.

Formulários

O meio Löwenstein-Jensen é usado para isolamento de micobactérias, de vários tipos de amostras. Recomenda-se realizar uma coloração de Ziehl-Neelsen em qualquer amostra em que a presença de micobactérias seja suspeita.

Algumas amostras vêm de locais estéreis, mas outros não. Amostras não -esterilizadas devem ser descontaminadas como o caso pode ser:

Escarro

As amostras de escarro devem ser descontaminadas da seguinte forma: determine a quantidade de amostra de escarro em ml e adicione à mesma quantidade de NaOH e incubo a 4% a 37 ° C.

Agite a mistura frequentemente durante um período de 30 minutos. Posteriormente centrifugue a 3000 rpm por 30 minutos.

Descarte o sobrenadante em uma solução desinfetante fenólica. Use o sedimento de semeadura, mas primeiro o pH deve ser neutralizado.

Para neutralizar o sedimento, h é usado₂SW₄ em 5% na presença do indicador de fenol vermelho até que leve a um pH neutro que origine uma cor de salmão.

Lavagem gástrica, lavagem brônquica e aspirado brônquico

Nesse caso, a amostra deve ser centrífuga a 3000 rpm por 30 minutos. O sobrenadante é descartado e o sedimento é usado. Para descontaminar o sedimento, 3 ml de NaOH a 4% são adicionados e freqüentemente agitados a 37 ° C por um período de meia hora.

Pode atendê -lo: estroma (histologia)

Centrífuga novamente, o sobrenadante é descartado e o sedimento é usado. O último deve ser neutralizado conforme explicado na amostra de escarro.

Urina

Deixe a amostra na geladeira por 24 horas. Separe o sobrenadante. O sedimento restante deve ser centrifugado por 30 minutos a 3000 RMP. Descarte o sobrenadante novamente e reconstituir o sedimento com 3 ml de solução fisiológica estéril.

Adicione 3 ml de NaOH a 4% e prossiga para a descontaminação e neutralização, conforme descrito antes.

Líquido ascítico, líquido pleural, líquido cefalorraquidiano

Neste tipo de amostra, é centrifugado e o sobrenadante é descartado. Faça um grama no sedimento ou observe diretamente no microscópio; Se as bactérias não forem observadas, a passagem da descontaminação não é necessária e nem a neutralização.

Nesse caso, a amostra pode ser semeada diretamente usando o sedimento. Se houver bactérias, prossiga para descontaminar e neutralizar como descrito acima.

Biópsias

Este tipo de amostra deve ser adicionado 5 ml de água destilada à centrífuga posterior a 1500 rpm por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e centrifugar o sedimento a 3500 rpm por 30 minutos. Use o sedimento para semear o meio de cultura.

Hiophare laringeal

O swab deve ser introduzido em um tubo estéril contendo partes iguais de água destilada e 4% de NaOH. O swab deve ser pressionado nas paredes do tubo para que a amostra seja diluída no líquido. Centrífuga e use sedimentos. Neutralizar o sedimento como já descrito.

Semeado

A mídia Löwenstein-Jensen é inoculada adicionando 0,5 ml da amostra na superfície do meio. Gire o tubo para distribuir a amostra por todo o meio. Não use alça de platina.

Você pode semear um segundo tubo contendo meio stonebrink para isolar Mycobacterium bovis e outras espécies que não crescem no ambiente Löwenstein-Jensen.

Incubação

Os tubos inoculados são incubados em aerobiose a 37 ° C, com uma tampa levemente preguiçosa e inclinados a aproximadamente 5 ° e protegidos da luz. O ambiente com dióxido de carbono pode ser enriquecido a 5-10%. Verifique as colheitas duas vezes por semana até o aparecimento de colônias.

Pode atendê -lo: exsudato nasal: para que serve, procedimento, cultivo

Quando a amostra é absorvida, as tapas são ajustadas. O tempo máximo de incubação é de 8 semanas, se após esse período não houver crescimento é relatado como negativo.

Controle de qualidade

Como controle de qualidade, você pode usar as seguintes cepas:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294,  Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045

Para as três primeiras espécies mencionadas, é esperado um excelente desenvolvimento, para M. Fortuitum O crescimento deve ser bom, enquanto para M. Bovis Espera -se um crescimento escasso ou zero. Enquanto, outras espécies que não o gênero Mycobacterium devem ser completamente inibidas.

Limitações

O meio preparado deve se proteger da luz, a exposição prolongada à luz faz com que o vire médio de verde para azul, neste caso o meio não pode mais ser usado. Isso ocorre porque o verde da malaquita é fotossensível.

O meio, como contém ovo, pode ser facilmente contaminado se não for manipulado assepticamente. Pode ser dissolvido se contaminado com bactérias proteolíticas.

O cultivo e a manipulação de bactérias do gênero Mycobacterium requer pessoal qualificado, que está ciente das medidas de biossegurança que devem ser cumpridas para evitar serem contaminadas ou contaminando outras pessoas.

O HCL não deve ser usado na passagem da neutralização devido à formação de cloreto de sódio, que pode ser tóxico para o Koch Bacillus.

As amostras devem ser mantidas refrigeradas e protegidas da luz, desde que não sejam processadas.

Referência

1. Laboratórios Francisco Soria Melguizo. 2009. Médio seletivo de Löwenstein-Jensen. Disponível em: F-Soria.é
2. Laboratórios da Britânia. 2017. Médio Löwenstein-Jensen. Disponível em: Britanialab.com.
3. Laboratórios Neogen. Médio Löwenstein-Jensen. Disponível em: FoodSafety.Neogen.com.
4. "Médio de Löwenstein-Jensen." Wikipedia, enciclopédia livre. 20 de novembro de 2018, 15:15 UTC. 24 de abril de 2019, 18:34. Wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. 5ª ed. Pan -American Editorial S.PARA. Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Pan -American Editorial S.PARA. Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Testes bioquímicos para a identificação de bactérias de importância clínica. 3ª ed. Editorial pan -americano. bons ares. Argentina.