Fundação de Imunofluorescência, Protocolo e Aplicações

O imunofluorescência É uma poderosa técnica de imunomarcy que usa anticorpos unidos covalentemente a moléculas fluorescentes para identificar alvos específicos em amostras de células fixadas em um suporte sólido.

Essa técnica observação microscópica com especificidade imunológica, possibilitando a observação de células vivas ou mortas que podem ter pequenas quantidades de antígenos. É amplamente utilizado no campo da pesquisa e no diagnóstico clínico de várias patologias.

Imunomariedade dos filamentos de actina em células de cardiomiócitos (Fonte: PS1415 [CC BY-SA 4.0 (https: // CreativeCommons.Org/licenças/BY-SA/4.0)] via Wikimedia Commons)

Essa técnica principalmente qualitativa (com algumas variantes quantitativas) tem a fazer especificamente com a visualização de uma amostra pelo produto de um fluoróforo, que é uma molécula fluorescente ligada a um anticorpo e que é capaz de se excitar em um certo comprimento de onda.

No contexto celular, é muito útil estudar a presença/ausência e a localização subcelular das proteínas. A técnica foi usada em seu início no campo clínico para o diagnóstico de vírus como influenza e, posteriormente, para muitas outras doenças infecciosas.

É uma técnica de grande sensibilidade e, com a equipe de microscopia adequada, pode ter uma resolução muito boa. Requer, para sua observação, o uso de microscópios confocais ou de epifluorescência.

No entanto, apesar de ser muito popular, você pode apresentar alguns problemas importantes sobre a obtenção de fluorescência inespecífica que gera um certo "ruído" em segundo plano, o que geralmente limita a leitura adequada dos resultados.

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Base

A imunofluorescência é baseada na exploração do fenômeno biológico da reação de interação entre um anticorpo e um antígeno. Tem a fazer especificamente com a visualização ou detecção dessa reação ao emocionante moléculas fluorescentes em um comprimento de onda específico.

Um anticorpo é uma proteína de imunoglobulina secretada de células B ativas e é especificamente gerada contra um antígeno, que pode ser unido com grande afinidade e especificidade. A imunofluorescência faz uso de imunoglobulinas de IgG, que são encontradas solúveis em soro sanguíneo.

Os anticorpos são moléculas de até 950 kDa compostos por dois peptídeos curtos (luz) e dois comprimentos na forma de "y" (pesado). As cadeias leves e pesadas são divididas em dois domínios: uma variável, capaz de reconhecer o antígeno e outra constante ou preservada, característica de cada espécie.

Os antígenos são funcionalmente definidos como moléculas que podem ser reconhecidas por um anticorpo e são principalmente proteínas. Quando um animal é exposto a um antígeno, os linfócitos do sistema imunológico são ativados, produzindo anticorpos específicos contra ele e funcionando como um sistema de defesa.

Um antígeno, como uma proteína, por exemplo, pode ter mais de um epítopo ou local de reconhecimento por um anticorpo; portanto, o soro do animal exposto a um antígeno pode ter anticorpos policlonais contra diferentes regiões da mesma proteína.

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A imunofluorescência, então, explora a capacidade de um animal de produzir anticorpos policlonais contra um antígeno específico para purificá -lo e posteriormente usá -lo para a detecção do mesmo antígeno em outros contextos.

Entre os corantes ou moléculas fluorescentes mais utilizadas para algumas técnicas de imunofluorescência, estão os isootiocianato de fluoresceína (FITC), tetrametilrodamina-5 e 6 (Tritc) isocianato, muitas cianinas como Cy2, Cy5, Cy5 e Cy7 e Dyes chamado Alexa Fluor®, como Cy2, Cy5, Cy5 e Cy7 e Dyes chamado Alexa. Fluor®448.

Protocolo

O protocolo de imunofluorescência varia dependendo de muitos fatores, no entanto, e em geral, abrange uma sequência linear de etapas que consistem em:

• Preparação de folhas e células
• Fixação de amostra
• Permeabilização
• Bloqueando
• Imunotivo ou imunomarcaje
• Assembléia e observação

-Preparação

Das amostras

A preparação das amostras dependerá de sua natureza e do tipo de experiência a ser realizada. Em seguida, o caso mais simples será explicado, o que implica o uso de células suspensas.

As células de suspensão, isto é, em um meio de cultura líquida, devem ser primeiro separadas por centrifugação e depois devem ser lavadas com uma solução tampão ou “amortecedor" isosmótico, que preserva sua integridade.

Normalmente, um tampão de fosfato-salina é usado como PBS, no qual as células são ressuspensas.

Dos lençóis

As folhas usadas para observação microscópica, onde as células serão definidas para os tratamentos a jusante correspondentes, também devem ser cuidadosamente preparados.

Eles são cobertos ou "sensibilizados" com uma solução de polisina, um polímero sintético que servirá como "cola molecular" entre células e suporte sólido, graças à interação eletrostática entre as cargas positivas de seus grupos amino e as cargas negativas de proteínas que cobrem células.

Fixação de amostra

Este processo consiste em imobilizar as proteínas que estão no interior celular, a fim de manter intacta seu local espacial. As moléculas utilizadas devem ser capazes de cruzar todos os tipos de membranas celulares e formar quadros com proteínas covalentes.

O formaldeído e paraformaldeído, glutaraldeído e até metanol são amplamente utilizados, com os quais as amostras de células são incubadas por um determinado tempo e depois lavá -las com uma solução de tampão isosmótico.

Após a fixação das células, ele continua a se juntar a elas nas folhas previamente sensibilizadas com polisina.

Permeabilização

Dependendo do tipo de teste realizado, será necessário permeabilizar ou não as células em estudo. Se o que é procurado é saber a localização, presença ou ausência, de uma certa proteína na superfície celular, a permeabilização não será necessária.

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Por outro lado, se você quiser saber a localização de uma proteína dentro do interior celular, a permeabilização é indispensável e consistirá em incubação de amostras com Triton X-100, um detergente capaz de permeabilizar as membranas celulares.

Bloqueando

Um passo fundamental em todas as técnicas imunológicas está bloqueando. Nesta fase do procedimento, o bloqueio consiste em cobertura, nas folhas sensibilizadas, todos os locais com moléculas de poliesina às quais as células não eram respeitadas. Isto é, evita qualquer união inespecífica.

Normalmente, para bloquear soluções com albumina de leite bovino (BSA) é usado em tampão PBS e os melhores resultados são obtidos quanto mais tempo é o tempo de incubação com esta solução. Após cada etapa, incluindo o bloqueio, é necessário remover a solução restante lavando.

Imunotivo ou imunomarcaje

O procedimento de imunomariedade ou imunomaridade dependerá principalmente se for uma imunofluorescência direta ou indireta (ver posteriormente).

Se for uma imunofluorescência primária ou direta, as amostras serão incubadas com os anticorpos desejados, que devem ser acoplados a corantes fluorescentes. O procedimento de incubação consiste em fazer uma diluição do anticorpo em uma solução que a BSA também conterá, mas em uma proporção mais baixa.

Quando o caso é o de uma imunofluorescência secundária ou indireta, duas incubações consecutivas devem ser feitas. Primeiro com os anticorpos desejados e depois com os anticorpos capazes de detectar as regiões constantes de imunoglobulinas primárias. São esses anticorpos secundários que são unidos covalentemente a fluoróforos.

A técnica é muito versátil, permitindo marcas simultâneas de mais de um antígeno por amostra, desde que tenham anticorpos primários acoplados a diferentes fluoróforos, no caso de imunofluorescência direta.

Para marcas simultâneas na imunofluorescência indireta, é necessário.

Como o bloqueio, a incubação com anticorpos fornece melhores resultados, maior o tempo disso. Após cada etapa, é necessário lavar o excesso de anticorpos que não se juntaram às amostras e, na imunofluorescência secundária, é necessário bloquear antes de adicionar o anticorpo secundário.

Certas técnicas usam outros corantes que não têm nada a ver com imunomaridade, como a coloração de DNA nuclear com o fluoróforo dapi.

Assembléia e observação

Durante o tempo final de incubação com fluoróforos, é necessário que as amostras permaneçam no escuro. Para observação do microscópio, é comum.

Pessoal

Resumo gráfico da imunofluorescência direta e indireta (Fonte: Westhayl618 [CC BY-SA 4.0 (https: // CreativeCommons.Org/licenças/BY-SA/4.0)] via Wikimedia Commons)

Imunofluorescência direta ou primária

Tem a ver com a detecção de antígenos através do uso de anticorpos fluorescentes. A principal vantagem do uso dessa técnica é sua velocidade, no entanto, muitos casos de união inespecífica podem ocorrer no processo, principalmente ao estudar soros humanos, porque são ricos em anticorpos muito heterogêneos.

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Imunofluorescência indireta ou secundária

Também é conhecida como a técnica "sanduíche" e isso implica o desenvolvimento da técnica em duas etapas. O primeiro tem a ver com o uso de um anticorpo não fluorescente e sua união ao antígeno de interesse.

Contra a região constante deste primeiro anticorpo (que agora servirá como antígeno) um segundo anticorpo capaz de reconhecê -lo é usado, que está associado a uma molécula fluorescente.

O aparecimento de um sinal fluorescente será o resultado do reconhecimento específico entre o primeiro anticorpo não fluorescente e o antígeno de interesse; A presença desse primeiro anticorpo condiciona a do segundo, que é rotulada e graças à qual a presença ou ausência do antígeno pode ser determinada.

Apesar de ser uma técnica que consome muito mais tempo do que a imunofluorescência direta (uma vez que inclui uma etapa mais de incubação), essa técnica não implica o design de um anticorpo fluorescente para cada antígeno estudado, o que resulta, em termos econômicos, mais viáveis.

Além disso, é uma técnica mais sensível em termos de amplificação de sinal, uma vez que mais de um anticorpo secundário pode se juntar à região constante do anticorpo primário, ampliando assim a intensidade do sinal fluorescente.

Formulários

Como observado anteriormente, a imunofluorescência é uma técnica extremamente versátil, para a qual foram fornecidas multiplicidade de usos nos campos científicos e clínicos. Pode ser usado para responder a questões ecológicas, genéticas e fisiológicas sobre muitos organismos.

Entre as aplicações clínicas, é usado para o diagnóstico direto de algumas doenças dermatológicas, seja usando imunofluorescência direta ou indireta no tecido epitelial dos pacientes estudados.

Técnicas de imunofluorescência foram organizadas em organismos unicelulares, como leveduras para visualizar microtúbulos intranucleares e citoplasmáticos, actina e proteínas associadas, filamentos de 10nm e outros constituintes do citoplasma, membrana e paredes de células.

Referências

1. Abcam, imunocitoquímica e protocolo de imunofluorescência. Recuperado de Abcam.com
2. Greph, c. (2012). Corantes fluorescentes. Recuperado de Leica-Microsystems.com
3. Miller, d. M., & Shakest, D. C. (novecentos e noventa e cinco). Microscopia de imunofluorescência. Em Métodos em biologia celular (Vol. 48, pp. 365-394). Academic Press, Inc.
4. Odell, i. D., & Cook, D. (2013). Técnicas de imunofluorescência. Jornal de Dermatologia Investigativa, 133, 1-4.
5. Príncipe, b. J. R., Adams, a. E. M., Druain, d. G., & Brian, K. (1991). Métodos de imunofluorescência para yeas. Em Métodos de enzimologia (Vol. 194, pp. 565-602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, m., Orsi, e. V, & widelock, D. (1964). Aplicações de imunoflorência na virologia da saúde pública. Revisões bacteriológicas, 28(4), 402-408.
7. Vrieling, e. G., & Anderson, D. M. (mil novecentos e noventa e seis). Imunofluorescência na pesquisa de fitoplâncton: aplicações e potencial. J: Phycol., 32, 1-16.