Eletroforese da fundação, técnica, para que é, exemplos

O Eletroforese É uma técnica usada para separar moléculas em um campo elétrico. Tem que fazer, especificamente, com a migração de partículas carregadas sob a influência de uma corrente elétrica aplicada entre dois pólos, um positivo e outro negativo.

Atualmente, a eletroforese é um dos procedimentos mais rotineiros que ocorrem durante o desenvolvimento de um experimento, especialmente em campos relacionados à química analítica, bioquímica e ciências biológicas e médicas em geral.

Bucket de eletroforese. Fonte: Melodygar/CC BY-SA (https: // CreativeCommons.Org/licenças/BY-SA/4.0)

É usado para separar proteínas, peptídeos, DNA, RNA e outros de acordo com sua carga, tamanho, densidade e pureza.

As diferentes casas comerciais projetaram formatos diferentes, com aplicações diferentes e lucros apropriados para fins específicos, no entanto, todos os procedimentos exigem os mesmos elementos básicos:

- Uma fonte de energia para gerar carga elétrica

- Um meio de apoio à separação

- Uma solução buffer (amortecedor) Para manter o pH constante

[TOC]

Base

A eletroforese nada mais é do que a migração (separação) de partículas ou moléculas carregadas (natural ou artificialmente) em um meio ou suporte sob a influência de um campo elétrico.

A técnica é baseada em uma das principais equações físicas do eletromagnetismo, segundo a qual a força é igual à carga elétrica multiplicada pelo campo elétrico aplicado nesse ponto (F (força) = q (carga elétrica) x E (campo elétrico ).

De acordo com esta equação, duas partículas com a mesma massa, mas de carga diferente, passarão para taxas diferentes no mesmo campo elétrico. Além disso, a velocidade de movimento dessas partículas dependerá da relação entre sua carga e sua massa.

Os cientistas aproveitaram essas propriedades e relações de carga/massa para separar os componentes das biomoléculas em suas partes menores, bem como separar diferentes moléculas em uma mistura, entre outras aplicações.

É importante lembrar que moléculas biológicas, como aminoácidos, peptídeos, proteínas, alguns carboidratos, nucleotídeos e ácidos nucleicos, todos têm algo que chamamos de "grupos ionizáveis", para que possam existir como espécies positivas ou negativamente carregadas sob certas condições de pH.

Técnica

Embora existam vários tipos de eletroforese, a eletroforese em gel é a mais usada em análise bioquímica, biologia molecular e biotecnologia, por isso será o que falaremos brevemente em termos técnicos.

Como o nome indica, a eletroforese em gel implica o uso de um meio de suporte sólido em forma de sólido, para a análise/separação de misturas de ácidos proteicos ou nucleicos (DNA e/ou RNA) sob a influência de um campo elétrico.

O sistema ou aparelho usado para realizar uma “corrida” eletroforética pode ser horizontal (geralmente usado para ácidos nucleicos) ou vertical (geralmente usado para proteína).

- Exemplo da técnica de eletroforese com ácido nucleico

Os ácidos nucleicos são geralmente separados usando géis de agarose (polissacarídeo de galactose) que são preparados com uma solução tampão adequada (Tris/acetato/EDTA ou Tris/Borato/EDTA) e cuja concentração determinará a "resolução" de fragmentos de tamanhos diferentes.

Pode servir você: cadeia alimentar da Terra: links e exemplo

Preparação de amostra

O primeiro passo antes de realizar uma execução eletroforética em um gel de agarose é obter a amostra. Isso dependerá da extremidade experimental e as amostras podem ser o produto de uma digestão enzimática, em uma reação em cadeia da polimerase (PCR), uma purificação de ácidos nucleicos, etc.

Mistura da amostra com o buff de carga.Org/licenças/por/4.0) via Wikimedia Commons)

Após a obtenção, isso é misturado com uma solução colorida (solução de carga) que permite a deposição rápida da amostra em um poço, pois possui glicerol e um corante que permite a execução visualmente.

Preparação em gel

Esta etapa consiste em misturar a quantidade necessária do substrato gelificante (o agarose) com a solução de buffer, derretendo -o usando calor e solidificando -o em um suporte que funciona como "mofo".

Durante a gelificação, alguns "pentes" são introduzidos no gel posicionado no "molde" para delimitar os "poços" onde as amostras serão introduzidas antes da corrida.

Depois que o gel resfriado e solidificado, os "pentes" são removidos e são introduzidos em um recipiente conhecido como "balde", que está cheio de solução de buffer de execução (Tris/Acetato/EDTA ou Tris/Borato/Borato/EDTA).

Este balde está, por sua vez, incluído no que é chamado de "câmara eletroforética", que nada mais é do que o recipiente através do qual o campo elétrico é passado e que tem um espaço onde o gel é introduzido e duas seções com as quais eles são preenchidos solução de buffer (amortecedor correr).

Esta câmera possui dois eletrodos, um positivo e um negativo, entre os quais o movimento de íons é produzido após a aplicação de um campo elétrico (está conectado a uma fonte de energia).

Carregando amostras

Depois que as amostras se misturam com a respectiva solução de carga, elas são introduzidas nos "poços" previamente feitos no gel.

Como os ácidos nucleicos têm uma carga líquida negativa, eles migram do pólo negativo para o positivo; portanto, isso deve ser levado em consideração quando a câmera estiver conectada à fonte de energia, garantindo que o pólo negativo corresponda ao local mais próximo ao local onde as amostras foram carregadas.

O tempo da Corrida é estabelecido em estrita dependência do pesquisador responsável pelo experimento. A tensão é geralmente calculada em uma razão de 5 volts por cento no gel que separa os dois eletrodos.

Mostrar

Quando o gel é executado (quando as amostras viajaram o gel de uma extremidade para a outra), ele é submerso em uma solução de brometo etídeo (ETBR), um corante que é intercalado entre as bases nitrogenadas e a "marca", então Eles podem ser visualizados em um transilumenante usando luz ultravioleta.

Para que é eletroforese para?

A eletroforese tem sido historicamente usada com vários propósitos. Hoje, no entanto, sua utilidade depende em grande parte da "pergunta" que o pesquisador é perguntado em relação a um fenômeno ou um sistema específico, bem como o tipo de eletroforese que ele deseja usar.

Pode atendê -lo: topoisomerase: o que são, características, funções, tipos

No entanto, podemos recrutar algumas das principais funções que essa técnica tem, começando com a mais "rara" e terminando com os mais populares e principalmente explorados no mundo das ciências biológicas. Eletroforese é útil:

- Para a análise quantitativa de misturas complexas de macromoléculas e para o cálculo do potencial "zeta" (propriedade coloidal de uma partícula em um meio líquido sob a influência de um campo elétrico estático).

- Para a análise de soros de sangue para fins de diagnóstico.

- Para a separação de glicoproteínas, lipoproteínas e hemoglobina no sangue.

- Para análise de alimentos, produtos farmacêuticos e poluentes ambientais.

Eletroforese em géis de agarose

- Para a separação de fragmentos de DNA após digestão com enzimas de restrição.

- Para a separação de moléculas de ácido nucleico antes da transferência para membranas para análises subsequentes.

- Para a análise de produtos de PCR (reação em cadeia da polimerase), verificando se ocorreu ou não.

- Para a estimativa do tamanho das moléculas em uma mistura de DNA ou RNA.

- Para a estimativa da quantidade e/ou a qualidade dos ácidos nucleicos purificados.

Eletroforese em géis de poliacrilamida sob condições desnaturalizantes ou nativas

- Para determinar o tamanho de uma proteína.

- Para identificar proteínas.

- Para determinar a pureza de uma amostra após várias etapas de purificação.

- Para identificar a presença de links de dissulfeto intramolecular.

- Para determinar a interação entre proteínas.

- Para determinar o ponto isoelétrico de uma proteína.

Fotografia de um gel de acrilamida após a execução de várias amostras de proteínas (fonte: Larionova.Marina/CC BY-SA (https: // CreativeCommons.Org/licenças/BY-SA/4.0) via Wikimedia Commons)

Fatores que afetam a eletroforese

A migração de uma partícula em um campo elétrico depende de vários fatores, entre os quais estão:

- Sua carga elétrica

- Seu tamanho molecular

- Sua hidrofobicidade e sua forma

- A magnitude do campo elétrico que é aplicado

- A temperatura do sistema e a força iônica da solução tampão usada

- A natureza do ambiente onde está localizado

Em relação à amostra

Entre os parâmetros relacionados às partículas (amostra) sujeitas a um campo elétrico, os principais fatores que afetam esse processo têm a ver com sua carga, seu tamanho e forma.

Quanto maior a carga líquida de uma partícula, maior sua taxa de migração e essa magnitude dependerão do pH. No entanto, a relação com o tamanho é inversamente proporcional, o que significa que quanto mais "grande" a molécula, mais lentamente migra.

Pode atendê -lo: Lia Agar (Iron Lysine): o que é, fundamento, preparação, usa

Em relação ao campo elétrico

Até agora, conversamos sobre a importância do campo elétrico para alcançar o movimento de uma partícula por eletroforese, mas não definimos o que é: força elétrica por unidade de carga ou, em termos mais simples, uma região de espaço onde existe uma força elétrica.

Os parâmetros relativos ao campo elétrico que podem afetar a migração são tensão, corrente e resistência.

A tensão afeta o “tempo de voo” das moléculas que são separadas após a aplicação do campo elétrico. Quanto maior é, mais rápido esse movimento.

Os elétrons atuais (contínuos e uniformes que são "empurrados" pela fonte de tensão) são realizados entre os eletrodos do sistema eletroforético, graças aos íons presentes na solução tampão. Está diretamente relacionado à tensão.

Em relação à solução buffer

A composição, a força iônica e o pH da solução tampão são os principais parâmetros que afetam uma "corrida" eletroforética, pois eles influenciam diretamente algumas das propriedades das amostras, especialmente a carga elétrica.

Porque? A solução tampão estabiliza o pH do meio de suporte onde a eletroforese ocorre. Sua composição pode afetar o deslocamento das partículas de migrar e a concentração iônica também, pois está diretamente relacionada à corrente.

Em relação ao meio de suporte

Os diferentes tipos e formatos de eletroforese também apresentam meios diferentes nos quais a migração ocorre e onde pode ser posteriormente "registrada".

A taxa de migração das moléculas submetidas a eletroforese depende do tipo de meio de suporte, que geralmente deve ser inerte.

Suas características de absorção, eletroendo-osmose é importante (capacidade de movimento de um líquido através de uma membrana sob a influência de um campo elétrico) e sua capacidade de peneira molecular.

Exemplos de uso de eletroforese

Exemplos clássicos de técnicas eletroforéticas usadas em biologia e biotecnologia incluem:

- Eletroforese em géis de agarose (inglês Gel de eletroforese)

- Eletroforese em géis de acrilamida em condições desnaturalizantes (SDS-PAGE, Inglês Eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio sulfato)

- Eletroforese em géis de acrilamida em condições nativas (BN-PAGE, Inglês Eletroforese em gel de poliacrilamida nativa azul)

- Eletroforese em duas dimensões (2ª páginas, do inglês Eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional)

- Eletroforese capilar (do inglês Eletroforese capilar)

- Isoletromosão (inglês Isoletrofoco)

- Eletroforese de campo pulsado (inglês Eletroforese em campo pulsado)

Referências

1. Beck, Kevin. (2020, 25 de maio). Os tipos de eletroforese. Cienting.com. Recuperado da ciência.com
2. Ensaios, Reino Unido. (Novembro de 2018). Tipos de eletroforese e aplicações. Recuperado de UKESSAYS.com
3. Nelson, d. eu., Lehninger, a. eu., & Cox, M. M. (2008). Lehninger Principles of Biochemistry. Macmillan.
4. Parmar, p. (Agosto de 2018). Eletroforese: significado, definição e classificação (com diagrama). Tecnologia biológica. Recuperado da biotecnologia.com
5. Perrett, d. (2010). 200 anos de eletroforese. Cromatografia. Hoje, 4-7.
6. Righetti, p. G. (2005). Eletroforese: a marcha de centavos, a marcha das moedas de dez centavos. Jornal de Cromatografia A, 1079 (1-2), 24-40.
7. Rilbe, h. (novecentos e noventa e cinco). SOM REMINISCIONES DA HISTÓRIA DE ELETROFORESA. Eletroforese, 16 (1), 1354-1359.
8. Vesterberg, OR. (1993). Uma breve história de métodos eletroforéticos. Eletroforese, 14 (1), 1243-1249.
9. Vinayagam, m. (Sem data). Fatores que afetam a eletroforese. Academia.Edu. Recuperado da academia.Edu