Thayer Martin Agar O que é, fundamento, preparação, usa

Ele Thayer Martin Agar É um meio sólido altamente nutritivo e seletivo para o isolamento de Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoeae; ambos conhecidos como importância patogênica ou clínica.

Um dos recursos especiais mais importantes apresentados pelo Thayer Martin Agar é seu alto teor em suplementos nutritivos. Esta propriedade é indispensável, porque as neisseries são microorganismos muito exigentes do ponto de vista nutricional e, portanto, não crescem em meios comuns.

Por outro lado, como esses microorganismos são normalmente encontrados em áreas não esterilizadas, é necessária a adição de inibidores que impedem o crescimento da flora que o acompanha, sem afetar o desenvolvimento do gênero Neisseria.

Este ágar é composto por ágar base GC, hemoglobina, suplementos nutricionais adicionais e um complexo de substâncias inibitórias (antibióticos e antifúngicos). Casas comerciais vendem cada um dos suplementos separadamente.

A amostra para semear neste meio dependerá do microrganismo que está sendo procurado. Para Neisseria Gonorrhoeae Amostras ideais são secreções vaginais e uretrais. Enquanto para Neisseria meningitidis As amostras mais utilizadas são o CSF, exsuda a faríngea e nasofaríngea.

Base

Neisseies são microorganismos catalogados como irritantes e, portanto, seu isolamento é difícil.  Portanto, Thayer Martín é um meio complexo e cada um de seus componentes cumpre uma função que é explicada abaixo:

Agar base GC

O ágar GC contém proteína peptona, amido de milho, cloreto de sódio, fosfato de dipotássio. Seus componentes fornecem nutrientes básicos para o desenvolvimento microbiano, neutralizam os ácidos graxos tóxicos, contribuem para manter o equilíbrio osmótico, definir o pH e fornecer consistência sólida ao ambiente.

Hemoglobina

A hemoglobina fornece fatores V e X (nicotinamida adenina dinucleotide nad e hemina, respectivamente). Portanto, neste meio, também cultiva espécies de Haemophilus. A hemoglobina pode ser obtida comercialmente desidratada ou pode adicionar bovino recém -desfibrinado ao meio ambiente.

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Suplemento de enriquecimento

Por outro lado, o meio Thayer-Martin também deve ser adicionado um suplemento de enriquecimento, uma vez que os nutrientes que o ágar base contém não são suficientes para os requisitos do gênero Neisseria.

O suplemento de enriquecimento mais usado é chamado isavalex. Isso contém glutamina, adenina, NAD, cocarboxilase, guanina, nitrato férrico, p-aminoácido benzóico, vitamina B12, tiamina e glicose. Todos esses compostos são necessários para o bom desenvolvimento de neisseries patogênicas.

Inibidores

Porque é um meio altamente nutritivo inibidores que impedem o crescimento de microorganismos da flora usual da área e, assim, favorece o isolamento do gênero Neisseria.

O complexo inibidor é composto por vancomicina, colistina e nistatina. A vancomicina inibe o crescimento de bactérias gram -positivas, a colistina impede o desenvolvimento de bactérias gram -negativas, como Pseudomonas e algumas neisseries saprófitas, e a nistatina atua em leveduras como leveduras como como leveduras como Candida Albicans.

No entanto, o Agar Thayer Martin foi modificado; As mudanças consistiram na adição de trimetoprim, o aumento da quantidade de ágar e o agregado de glicose extra. Essas mudanças melhoraram significativamente a recuperação das espécies de Neisseria gonorrhoeae.

Deve -se notar que o trimetoprim inibe o crescimento do gênero de proteínas e sua conseqüente formação de enxames. Nesse sentido, antibióticos são aqueles que fornecem o caráter seletivo ao médium thayer martin.

Preparação

Thayer Martin Agar original

-Agar GC

Pese 8,2 gr do meio GC desidratado e suspenda a 100 ml. Misture e ferva por 1 minuto com agitação frequente para se dissolver em sua totalidade. Esterilize a mistura em autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

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-2% de hemoglobina

Suspender 2 gr de hemoglobina desidratada em 2 ou 3 ml de água destilada quente para formar uma mistura uniforme. Adicione gradualmente água para completar um volume de 100 ml. A suspensão deve ser homogênea antes de esterilizar.

Esterilizar em autoclave por 15 minutos.

-Suplemento de enriquecimento

Reconstitua o frasco comercial com o diluente fornecido pela mesma casa comercial. Misture bem. A quantidade de diluir a ser usada será especificada na instrução do kit.

-Suplemento de inibição v.C.N (Vancomicina, Colistina, Nistatina)

Reconstituir o frasco com o diluente fornecido pela casa comercial. Misture bem. A quantidade de diluir a ser usada será especificada na instrução do kit.

-Preparado

Para cada 100 ml de ágar GC, proceda da seguinte forma:

Quando o ágar GC sai da autoclave, deixe esfriar até uma temperatura aproximada de 50 ° C e adicione 2 ml da solução de hemoglobina preparada, 2 ml do suplemento de enriquecimento (Isoobalex ou Bralex) e 2 ml do suplemento de inibição. Misture e sirva em placas estéreis de Petri.

Deixe solidificar e salvar na geladeira até usar.

A cor do meio preparado é vermelho cereja. O pH final do meio é 7,2 ± 0,2

Thayer Martin Agar modificado

Pese 8,2 gr do meio GC desidratado e suspenda a 100 ml. Adicione 1 gr de águas de ágar e adicione 0,3 gr de glicose. Misture e ferva por 1 minuto com agitação frequente para se dissolver em sua totalidade. Esterilize a mistura em autoclave a 121 ° C por 15 minutos.

Prepare a hemoglobina e o suplemento de enriquecimento, conforme descrito acima.

O suplemento de inibição usado é V.C.N.T (Vancomicina, Colistina, Nistatina, Tripetoprim).

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-Preparado

Prosseguir da maneira descrita para o ágar original de Thayer Martin.

Usar

Thayer Martin Agar deve estar temperado antes de semear as amostras. Amostras comumente usadas são exsudatos faríngeos, exsudatos nasais, vaginais, uretrais e/ou retais e CSF.

Use amostras recém -colhidas e faça inóculos fortes sobre o ágar. As amostras são semeadas diretamente devido à descarga do material e depois se destacaram devido à exaustão na superfície.

As placas são incubadas a 35-37 ° C por 24 a 48 horas em Microaerophilia Jug (5% CO₂). Após o tempo de incubação, as placas são examinadas em busca de pequenas colônias, a aparência cinza e às vezes mucóide.

Realize Gram e testes bioquímicos confirmatórios para colônias suspeitas.

Controle de qualidade

Para realizar o controle de qualidade, Thayer Martin pode usar as seguintes cepas microbianas.

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 e Neisseria meningitidis ATCC 13090; Em ambas as cepas, é esperado um desenvolvimento satisfatório.

As seguintes cepas também devem ser incluídas: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 e Candida Albicans ATCC 10231. Em todos eles, é esperada uma inibição total ou parcial neste meio.

Limitações

-Lembre -se de que nas bactérias médias resistentes aos inibidores usados ​​podem crescer.

-Existem cepas de Neisseria Gonorrhoeae que pode ser sensível à concentração de vancomicina usada. Por esse motivo, é recomendável usar um ágar de chocolate paralelo suplementado com isovalex, mas sem inibidores.

-Existem cepas de leveduras resistentes à nistatina que podem crescer neste meio e interferir no isolamento de neisseries patogênicas, especialmente gonococos.

Referências

1. Laboratórios da Britânia. Thayer Martin Media modificada. Disponível em: Britanialab.com