Müeller Hinton Agar O que é, fundamento, preparação, usa

Ele Müeller Hinton Agar É um meio nutricional sólido e não seletivo, que é composto de infusão de carne, ácido peptona de caseína, amido, aderência e água destilada. Este meio permite um excelente desenvolvimento microbiano da maioria das bactérias de crescimento rápido.

Foi criado originalmente por John Howard Müeller e Jane Hinton para isolar bactérias exigentes do ponto de vista nutricional, como Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis. No entanto, devido às suas características, acabou sendo ideal para o estudo da suscetibilidade a antibióticos, fornecendo resultados confiáveis ​​e reproduzíveis.

Portanto, o Agar Müeller Hinton é o meio de cultura aceito pelo Instituto de Padrões Clínicos e do Laboratório (CLSI) e pelo Comitê Europeu de Teste de Susceptibilidade Antimicrobiana, para a execução do teste de suscetibilidade antimicrobiana pelo método de dissimulação de Kirby e Bauer.

Base

Por ser um meio nutricional não seletivo, é excelente para o crescimento da maioria das bactérias patogênicas.

Por outro lado, sua composição simples faz.

Outra de suas características é que ele contém baixo número de inibidores, o que permite sulfonamida, trimetoprim e tetraciclinas para avaliar efetivamente.

No entanto, deve -se ter em mente que o meio deve atender a certas condições para garantir seu funcionamento adequado, incluindo:

O ajuste do pH, a profundidade do ágar e a concentração adequada de Timina, Timidina, CA⁺⁺, Mg⁺⁺ e Zn⁺⁺.

Você também precisa saber que a metodologia é padronizada e, portanto, todos os parâmetros, como:

A concentração do inóculo, a concentração e conservação de discos antibióticos, a colocação do número adequado de discos no ágar, a distância entre um disco e o outro, a colocação estratégica de certos antibióticos, a atmosfera, a temperatura e o tempo de incubação.

Preparação

Pese 37 gr do meio Müeller Hinton desidratado e se dissolve em 1 litro de água destilada. Aqueça o meio ambiente enquanto mexendo para ajudar sua dissolução. Ferva por 1 minuto.

Traga para a autoclave para esterilizar a 121 ° C por 15 minutos. Ao remover da autoclave, a fixola deve ser colocada em um banheiro de María a 50 ° C para esfriar. Despeje 25 a 30 ml em placas de 10 cm estéril de 10 cm.

As placas devem ser deixadas com uma espessura média de 4 mm (ideal), uma faixa de 3-5 mm sendo permitida.

Se você deseja preparar o sangue usando Müeller Hinton, o sangue de cordeiro estéril a 5% é derramado como base.

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O pH final do meio deve estar entre 7,2 e 7,4.

Invista e salve na geladeira, até usar. Deixe a placa fazer a temperatura ambiente antes de usar.

A cor do meio preparado é o bege leve.

Formulários

É usado para realizar o antibiograma ou o teste de suscetibilidade aos antibióticos para os patógenos de crescimento mais rápidos.

Se o ágar for suplementado com sangue serve para realizar o antibiograma de microorganismos exigentes, como: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, entre outros. Também tem sido usado para isolar Legionel Pneumophila.

Técnica antibiograma

Antes de realizar o antibiograma, uma solução bacteriana equivalente a 1,5 x 10 deve ser preparada⁸ Células.

Para fazer isso, 3 a 4 colônias de colheita pura são tomadas e suspensas em um caldo de soja tripípio ou no caldo de Müeller Hinton, incuba por 2 a 6 horas e a concentração com uma solução salina estéril é ajustada, comparando -a com um padrão Mac Farland de 0,5%.

Se eles estão exigindo microorganismos, as colônias podem ser suspensas diretamente até a concentração de 0,5% do MAC Farland. Posteriormente, a placa Müeller Hinton é semeada com um swab impregnado com a solução bacteriana preparada.

Para fazer isso, o swab está imerso na solução e, em seguida, o excesso de fluido é removido pela pressão contra as paredes do tubo. Imediatamente após o swab passar por toda a superfície, sem sair sem tocar, então a placa é girada levemente e semeia novamente. A operação é repetida 2 vezes mais.

Deixe repousar por 10 minutos e depois coloque os discos de antibióticos com um grampo estéril, deixando um espaço de 24 mm entre um e o outro. Depois de colocar cada álbum no ágar, pressione cada um com o grampo para garantir que eles estejam bem anexados.

Após o processo, a placa é investida e 35-37 ° C é incubada em aerobiose por 16 a 18 horas. Se for um microorganismo exigente, pode merecer microaerofilia e se o antibiograma contiver discos de oxacilina, deve ser lido às 24 horas.

Para medir o diâmetro de cada halo, uma regra é usada. Os resultados devem ser registrados em mm. Posteriormente, os valores obtidos com as tabelas de pontos de corte publicados pelo manual CLSI atual estão correlacionados.

Relatório como sensível (s), intermediário (i) ou resistente (r), conforme o caso pode ser.

Antibióticos são selecionados de acordo com o microorganismo isolado e o tipo de infecção que está produzindo.

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Às vezes, a colocação estratégica dos antibióticos deve ser lembrada para mostrar padrões de resistência fenotípica.

Colocação estratégica de discos em Müeller Hinton Agar

Para Enterobactérias, o disco de ácido clavulânico deve ser colocado na frente da 3ª e 4ª geração cefalosporinas. Um alargamento em forma de ovo indica que a tensão é um produtor de beta -lactamases de espectro estendido (blee). Isso significa que o paciente não deve ser tratado com nenhuma cefalosporina.

Em Staphylococcus é importante.

Um halo resistente à eritromicina e uma planicidade no halo de clindamicina indica que a tensão tem uma resistência induzível à clindamicina, tensão (RIC). Isso significa que um tratamento com clindamicina não será eficaz.

Para a busca por cepas de AMP C induzíveis em enterobactérias e alguns bacilos, ceftazidima, cefofoxitina ou piperacilina não -fermentando.

Um halo dourado em um dos discos que o imipenem indica a presença de amp induzível C C.

Para a busca de amplificadores constitivos, um esgoto de 500 µg com disco cloxacilin. Uma largura de cura em uma das cefalosporinas indica positividade.

Você também pode substituir o disco de cloxacilina por 9 mm do papel de filtro Whatman No. 6 impregnado com ácido bórico (400 µg) com uma distância de 18 mm. É interpretado igual ao anterior.

Finalmente, para investigar a produção de metalobethalactamases, especialmente em Pseudomonas aeruginosa, É utilizado um disco impregnado com 10 µl de ácido etilendiaminterraacético (EDTA 750 µg) e ácido tioglicólico (SMA 300 µg), que enfrenta os discos de imipenem e meropenem, a uma distância de 15 mm.

O teste é positivo se houver ampliação de imipenem ou meropenem halos em direção ao álbum EDTA/SMA. Este resultado deve ser confirmado pelo teste de Hodge modificado.

Este método consiste em inocular uma tensão de Escherichia coli ATCC 25922 na placa Müeller Hinton. Um disco imipenem no centro da placa é colocado e, em seguida P. Aeruginosa suspeito. Você pode tentar até 4 tensões por placa.

O teste será positivo se houver uma zona de distorção do halo imipenem ao redor do STRO.

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Causas de resultados errôneos

-Os discos de antibióticos mal preservados podem produzir falsos resistências. Por exemplo, o disco de oxacilina é muito vulnerável a mudanças de temperatura.

-Um pH do meio abaixo do indicado (ácido) produz halos menores em aminoglicosídeos e macrólidos (risco de falsa resistência) e halos maiores em penicilina, tetraciclina e novobiocina (risco de falsa sensibilidade).

-Se o pH estiver acima do indicado (alcalino), os efeitos descritos acima são investidos.

-Os meios com altas concentrações de timina e timidina influenciam significativamente a redução de sulfonamida e a inibição do trimetoprim HALS.

-Altas concentrações de cálcio e magnésio produzem falsa resistência de aminoglicosídeos, polimixina B e tetraciclinas na frente de cepas de Pseudomonas aeruginosa.

-Baixas concentrações de cálcio e magnésio produzem falsas sensibilidades de aminoglicosídeos, polixina B e tetraciclinas na frente de cepas de Pseudomonas aeruginosa.

-A presença de zinco afeta os resultados dos discos de carbapenems (Imipenem, Meropenem e Ertapenem).

-A espessura do meio abaixo de 3 mm produz resultados de falsa sensibilidade, enquanto uma espessura acima de 5 produzirá falsa resistência.

-A mobilização de discos no antibiograma fornecerá halos deformados, uma vez que a descarga de antibióticos é imediata.

- Inoculares muito fracos afetam os resultados, pois não haverá uniforme ou convergirá crescimento no ágar, uma condição necessária para medir a inibição halos, além dos halos pode dar maior que o normal.

-Os inoculos muito carregados podem dar HALs menores que o normal.

-Não respeite a distância entre os discos faz com que um halo se sobreponha com outro e não pode ser lido corretamente.

-Incubar com co₂ Aumenta os halos dos discos de tetraciclina e meticilina.

-Incubar a temperaturas abaixo de 35 ° C produz halos maiores.

-O agregado de sangue diminui o tamanho do halo de sulfamida.

Limitação

A sensibilidade de um antibiótico demonstrado no antibiograma contra um microorganismo (Em vitro) Não é uma garantia de que funcionará Na Vivo.

Controle de qualidade

Para saber se o meio contém a quantidade certa de Timina, uma tensão deve ser semeada de Enterococcus faecalis ATCC 29212 e prove a suscetibilidade ao trimetoprim sulfametoxazol (SXT), ele deve dar um halo igual ou> 20 mm para ser satisfatório.

Referências

1. Cona e. Condições para um bom estudo de suscetibilidade por teste de disseminação em ágar. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
2. Laboratórios da Britânia. Müeller Hinton Agar. Disponível em: Britanialab.com