DNA técnico recombinante, aplicações e fundamentos

Ele DNA recombinante (DNA ou rDNA) é uma molécula de ácido nucleico artificial criado em laboratório, integrando dois segmentos de interesse do organismo. Também é conhecido como DNA quimérico, graças à sua propriedade híbrida. Não encontramos esse tipo de DNA na natureza.

A metodologia básica para gerá -la inclui: (a) a seleção de um DNA branco e sua inserção em outro fragmento de DNA (geralmente um plasmídeo bacteriano); (b) A introdução deste plasmídeo em uma bactéria, (c) a seleção de bactérias através de antibióticos e, finalmente (d) a expressão do gene.

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A técnica aproveita um jogo de enzimas que permite copiar e colar fragmentos específicos de DNA no estudo do pesquisador.

El objetivo de la tecnología recombinante es, en la mayoría de los casos, la expresión de una proteína (conocida como proteína recombinante) deseada por el biólogo molecular para futuras investigaciones o para crear una proteína de valor comercial y terapéutico - como la insulina humana, por exemplo.

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Fundamentos da técnica de DNA recombinante e seu uso em engenharia genética

O dogma central da biologia molecular

Todos os seres orgânicos que conhecemos compartilham várias características. Uma delas é a natureza do material genético e a maneira como as proteínas são produzidas - processo conhecido como "dogma" central da biologia molecular.

Com exceção de um par de vírus, todos os organismos armazenam informações genéticas no DNA (ácido desoxirribonucleico), coletadas muito compactas e organizadas no núcleo celular.

Para a expressão gênica, a molécula de DNA é transcrita para o RNA mensageiro, e o último é traduzido para a linguagem de aminoácidos, os blocos estruturais de proteínas.

O que é um DNA recombinante?

Entre os anos 70 e 80, os biólogos moleculares começaram a aproveitar os processos que ocorrem naturalmente dentro da célula e conseguiram extrapolá -los para o laboratório.

Dessa maneira, um gene animal (um vertebrado, por exemplo) pode ser inserido em um segmento de DNA de uma bactéria; ou o DNA de uma bactéria pode ser combinado com um DNA viral. Assim, podemos definir um DNA recombinante como uma molécula composta por DNA de dois organismos diferentes.

Uma vez que essa molécula híbrida ou recombinante foi criada, prosseguimos para a expressão do gene do interesse. Com a palavra expressão Queremos nos referir ao processo de tradução de proteínas.

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Restrição e enzimas das ligas: a chave para o processo

Um elemento -chave para desenvolver a tecnologia de DNA recombinante foi a descoberta de enzimas de restrição.

São moléculas de proteína que exibem a capacidade de dividir no DNA (nucleas) em sequências de concreto, servindo como "tesoura molecular". Os fragmentos gerados por essas enzimas são chamados fragmentos de restrição.

Essas enzimas podem produzir nos cortes simétricos da sequência branca (em ambas as correntes na mesma altura) ou cortes assimétricos. Um aspecto fundamental da ação das enzimas de restrição é que, após a divisão das cadeias, é obtida uma "borda solta", complementar à outra borda cortada pela mesma enzima.

Alguns exemplos são Ecor 1 e SMA 1. Mais de 200 tipos de enzimas de restrição são atualmente conhecidos e estão disponíveis comercialmente.

Para ser útil, uma tesoura deve ser acompanhada pela cola. Esta ação de vedação de DNA (anteriormente tratada com enzimas de restrição) é realizada por ligas.

Técnica: como é o DNA de um organismo em laboratório modificado artificialmente?

Em seguida, descreveremos as principais etapas exigidas pela tecnologia de DNA recombinante. Todos são realizados por profissionais em um laboratório de biologia molecular.

O que é um "clone"?

Antes de continuar com o protocolo experimental, devemos notar que na biologia molecular e biotecnologia o termo "clone" e o verbo "clonar" são amplamente utilizados. Isso pode levar à confusão.

Nesse contexto, não nos referimos à clonagem de todos um organismo (como no caso das famosas ovelhas Dolly, por exemplo), mas para a clonagem de um fragmento de DNA, que pode ser um gene. Isto é, produzir muitas cópias - geneticamente idênticas - da sequência.

1. Isolamento e obtenção de DNA

O primeiro passo é decidir qual sequência deseja ser usada. Isso depende totalmente do pesquisador e dos objetivos de seu trabalho. Então, este DNA deve ser isolado e purificado. Os métodos e procedimentos para conseguir isso dependem do organismo e do tecido.

Uma porção de tecido é geralmente tomada e passando por um tratamento em um fã de lise. Posteriormente, a fragmentação de material genético em pequenos fragmentos é procedido.

2. Vetor de clonagem

Após as etapas preparatórias, o pesquisador procura introduzir o segmento de DNA de interesse em um vetor de clonagem. De agora em diante este segmento de DNA, chamaremos de DNA branco.

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Plasmídeos

Um dos vetores mais utilizados em um plasmídeo de origem bacteriana. Um plasmídeo é uma molécula de DNA circular de dupla cadeia que encontramos naturalmente em bactérias. São entidades fora do cromossomo bacteriano - ou seja, são extracromossômicas e são naturalmente encontradas nesses procariontes.

Os elementos básicos de um vetor são: (a) uma origem da replicação, que permite a síntese de DNA; (b) agente de seleção, que permite identificar organismos que carregam o plasmídeo com DNA branco, como resistência a um antibiótico; e (c) local de multiclonação, onde as seqüências que serão reconhecidas por enzimas de restrição são encontradas.

O primeiro DNA recombinante bem -sucedido no laboratório foi clonado no plasmídeo PSC101 das bactérias E. coli. Isso contém um local de restrição para a enzima de restrição ecori e um gene de resistência a um antibiótico, além da origem da replicação.

A inserção do DNA branco no plasmídeo é feita usando as ferramentas moleculares de enzimas de restrição e ligas descritas na seção anterior.

Tipos substantivos de vetores

Além dos plasmídeos, o DNA pode ser inserido em outro vetor, como o bacteriófago lambda.

3. Introdução de DNA recombinante

Uma vez que a molécula de DNA recombinante (gene de interesse no plasmídeo ou outro vetor) foi obtido.

Para introduzir DNA estranho em uma bactéria, é usada uma técnica chamada transformação bacteriana, onde o corpo é submetido a um tratamento com cátions divalentes que o torna suscetível à tomada de DNA.

Metodologicamente, não podemos garantir que 100% das bactérias em nossa colheita tenham efetivamente nossa molécula de DNA recombinante. É aqui que a parte do plasmídeo que contém resistência a antibióticos entra em jogo.

Assim, bactérias que tomaram o plasmídeo serão resistentes a um certo antibiótico. Para selecioná -los, será suficiente para a aplicação do referido antibiótico e levar os sobreviventes.

4. Proteína "colheita"

Depois de selecionar bactérias com nosso DNA recombinante, passamos a usar a maquinaria enzimática do hospedeiro para gerar o produto proteico de interesse. À medida que as bactérias são reproduzidas, o plasmídeo passa para sua prole, por isso não se perde durante a divisão.

Este procedimento usa bactérias como uma espécie de "fábrica" ​​de proteína. Mais tarde, veremos que tem sido um procedimento muito relevante no desenvolvimento de tratamentos médicos eficazes.

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Uma vez que a colheita estiver pronta e as bactérias produziram grandes quantidades de proteínas, a célula ou a ruptura da célula é. Existe uma ampla gama de técnicas bioquímicas que permitem a purificação de proteínas de acordo com suas características físicas-químicas.

Em outro contexto experimental, podemos não estar interessados ​​em gerar proteínas, mas estamos interessados ​​em obter a sequência de DNA por si só. Se fosse o caso, o plasmídeo serviria para a criação de várias cópias do fragmento que nos interessam com o objetivo de ter quantidade suficiente do DNA branco para realizar as experiências relevantes.

Formulários

A tecnologia de DNA recombinante abriu um número infinito de possibilidades à biologia molecular, biotecnologia, medicina e outras áreas relacionadas. Seus aplicativos mais destacados são os seguintes.

Análise genética

A primeira aplicação está diretamente relacionada aos laboratórios de biologia molecular. A tecnologia de DNA recombinante permite que os pesquisadores entendam a função normal dos genes, e proteínas geradas podem ser usadas na pesquisa subsequente.

Indústria farmacêutica

As proteínas produzidas usando o procedimento de DNA recombinante têm aplicações em medicina. Dois exemplos muito relevantes no campo são a insulina humana e o hormônio do crescimento, que é aplicado em pacientes sem essa proteína.

Graças ao DNA recombinante, essas proteínas podem ser geradas sem a necessidade de extrair de outro ser humano, o que representa complicações metodológicas adicionais e riscos à saúde. Isso ajudou a melhorar a qualidade de vida de inúmeros pacientes.

Referências

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